Διερεύνηση της εμπλοκής του πρωτεοσώματος στην παθογένεση του πτερυγίου

Abstract

Background: Pterygium is an eye disorder featuring hyperplasia of the cornea epithelium, usually bilateral, overgrowth of stromal fibroblasts and blood vessels, significant neovascularization, inflammatory cell infiltration and abnormal extracellular matrix accumulation, with elastin and collagen being the main components. Immuohistologic studies indicate that pterygium is rather a limbal epithelial stem cell disorder, the formation and development of which may be triggered from a damage or activation of these stem cells. The exact reasons of pterygium pathogenesis remain unclear, however ultraviolet (UV) radiation is considered to be the most acceptable cause for the initiation of this disorder. The 26S proteasome is an intracellular proteolytic complex of two components: a 20S proteolytic core, which contains the catalytic activity, and a 19S regulatory subunit. The 20S proteolytic core is constructed from 28 subunits, 14α and 14β, distributed in four heptameric rings stacked on top of each other, to form a structure resembling a barrel. The proteasome possesses multiple protease activities, such as caspase-like, trypsin-like and chymotrypsin-like activity, localized on subunits β1, β2 and β5, respectively, and is able to degrade almost all the intracellular abnormal and denaturated proteins, as well as functional proteins, which have to be recycled. The normal function of proteasome and the consequent selective degradation of oxidized proteins that it exerts, highly contributes in the cellular defenses against oxidative stress. In contrast, the impaired function of the proteasome, leads to accumulation of oxidized/misfolded proteins within the cell, and may be responsible for the manifestation several degenerative diseases. The proteasome subunits β5 (PSMB5), bearing chymotrypsin-like activity, is considered as the main proteasome subunit and its expression is mediated by Nrf2-ARE pathway in many cell types. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a predominantly pro-inflammatory mediator implicating in a variety of pathologic states. Many of its functions, such as the in vitro glucocorticoid counter-regulatory activity, the chemotactic activity on monocytes, the induction of IL-8 and TNF-α production by macrophages, the superoxide generation by neutrophils and the up-regulation of matrix metalloproteinases MMP-1 and MMP-3 expression by synovial fibroblasts, have been linked to its unusual enzymatic properties, namely tautomerase and oxidoreductase activities. Aim: This study investigates the expression of proteasome subunits in pterygium and the effect of UV irradiation on their expression in pterygium fibroblasts. Especially, the effect of UVB irradiation on the expression and activity of PSMB5 in pterygium fibroblasts and the mechanism that mediates this effect, are investigated. In addition, the presence of MIF in pterygium is presented, and its expression in pterygium fibroblasts under UVB irradiation as well as its implication in the effect of UVB irradiation on PSMB5 expression in pterygium fibroblasts, is investigated. Methods: Normal conjunctival and pterygium specimens were obtained from the superotemporal bulbar conjunctiva of healthy individuals undergoing cataract surgery and from patients undergoing surgical removal of primary tissue, respectively. Fibroblasts were isolated upon treatment of specimens with clostridium collagenase. The expression of PSMB5, Nrf2 and MIF in tissues and cells was ascertained by RT-PCR and qPCR analysis and western blotting. Cell survival was measured by the MTT method and the proteasome chymotrypsin-like activity was determined by fluorometry. The MIF levels in cell cultures conditioned media were determined by ELISA and its identification in these media was ascertained by western blotting. Results: RT-PCR analysis showed that the expression of all proteasome subunits were significantly lower in pterygium than in normal conjunctiva. Upon UV (UVA and UVB) irradiation exposure of pterygium fibroblasts a suppression of their expression was observed. The expression of PSMB5 was mediated by the Nrf2/ARE pathway as indicated by using the Nrf2 activator Oltipraz. The expression of PSMB5 and Nrf2 by pterygium fibroblasts was suppressed in a dose-dependent manner following UVB radiation of 0–50 mJ/cm2 doses. The expression of PSMB5, but not of Nrf2, remained at almost the control levels, when UVB exposure was performed after pre-incubation of cells with the src kinases inhibitor PP2, indicating that some src kinase is implicated in the suppression of PSMB5 caused by UVB irradiation. UVB-irradiation had the same effect, but to a lower extent, on PSMB5 expression in normal conjunctival fibroblasts, indicating that the observed effect of UVB-irradiation on pterygium fibroblasts was not the result of degeneration of these cells due to irradiation. UVB irradiation had very low deleterious effect on fibroblasts survival, while it did not affect the proteasome chymotrypsin-like activity. RT-PCR analysis showed also that the expression of MIF was higher in pterygium than in normal conjunctiva. Upon UVB exposure of pterygium fibroblasts at irradiation doses 0-50 mJ/cm2, an irradiation dose-dependent enhancement of MIF expression and secretion in conditioned media was observed. In contrast, UVB irradiation had not any effect on MIF expression in normal conjunctival fibroblasts. The expression of PSMB5 remained at almost the control levels, when UVB exposure was performed after pre-incubation of cells with the MIF inhibitor ISO-1, indicating that MIF may be implicated in the suppression of PSMB5 caused by UVB irradiation. Conclusions: It appears that the UVB irradiation stimulates the expression of MIF in pterygium fibroblasts, that in turn, acting autocrineously, leads to down-regulation of Nrf2/ARE-mediated PSMB5 gene expression, through some src kinase of which the expression or activation it induces. It is known that MIF is able to induce the expression of various factors, such as cytokines and enzymes as well as that the proteasome is involved in the regulation of the expression of various factors, such as metalloproteinases and their inhibitors, cytokines and collagens, all of which may contribute in the formation and development of pterygium. Thus, it is reasonable to propose that the implication of UVB radiation in pterygium pathogenesis is partially mediated by the up-regulation of MIF expression and the consequent suppression of proteasome expression.

Εισαγωγή: Το πτερύγιο είναι μια οφθαλμική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από υπερπλασία του επιθηλίου του κερατοειδούς, συνήθως αμφοτερόπλευρη, υπερανάπτυξη ινοβλαστών του στρώματος και αιμοφόρων αγγείων, σημαντική νεοαγγείωση, κυτταρική φλεγμονώδη διήθηση και μη φυσιολογική συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, όπου η ελαστίνη και το κολλαγόνο είναι τα κύρια συστατικά. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι το πτερύγιο είναι μάλλον μια διαταραχή των επιθηλιακών βλαστοκυττάρων του σκληροκερατοειδούς, και ο σχηματισμός και η ανάπτυξή του μπορεί να προκληθεί από βλάβη ή ενεργοποίηση αυτών των βλαστοκυττάρων. Οι ακριβείς λόγοι της παθογένειας του πτερυγίου παραμένουν ασαφείς, ωστόσο η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία θεωρείται η πιο αποδεκτή αιτία για την έναρξη αυτής της διαταραχής.Tο 26S πρωτεάσωμα είναι ένα ενδοκυτταρικό πρωτεολυτικό σύμπλεγμα δύο συστατικών: ενός πρωτεολυτικού πυρήνα 20S, o οποίος περιέχει τη καταλυτική δραστικότητα, και μιας ρυθμιστικής υπομονάδας 19S. O πρωτεολυτικός πυρήνας 20S συγκροτείται από 28 υπομονάδες, 14α και 14β, κατανεμημένες σε τέσσερεις επταμερείς δακτυλίους στοιβαγμένους ο ένας πάνω στον άλλο, για να σχηματίσουν μία δομή που μοιάζει με βαρέλι. Το πρωτεάσωμα διαθέτει πολλαπλές δραστικότητες πρωτεάσης, όπως κασπάσης, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης, εντοπισμένες στις υπομονάδες β1, β2 και β5 αντίστοιχα, και είναι σε θέση να αποικοδομίσει σχεδόν όλες τις ενδοκυτταρικές μή φυσιολογικές και μετουσιωμένες πρωτεΐνες, καθώς και λειτουργικές πρωτεΐνες που ολοκλήρωσαν το χρόνο ζωής τους και πρέπει να ανακυκλωθούν. Η φυσιολογική λειτουργία του πρωτεασώματος και η επακόλουθη επιλεκτική αποικοδόμηση οξειδωμένων πρωτεϊνών που ασκεί, συμβάλει ιδιαίτερα στην κυτταρική άμυνα κατά του οξειδωτικού στρές. Αντίθετα, η μειωμένη λειτουργία του πρωτεασώματος, οδηγεί σε συσσώρευση οξειδωμένων/μή φυσιολογικών πρωτεϊνών εντός του κυττάρου και μπορεί να είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση αρκετών εκφυλιστικών ασθενειών. Η υπομονάδα β5 του πρωτεασώματος (PSMB5), που φέρει δραστικότητα χυμοθρυψίνης, θεωρείται ως η κύρια υπομονάδα του και η έκφρασή της διαμεσολαβείται από το Nrf2/ARE μονοπάτι σε πολλούς τύπους κυττάρων. Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) είναι ένας κυρίως προ-φλεγμονώδης μεσολαβητής που εμπλέκεται σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων. Πολλές από τις λειτουργίες του, όπως η “in vitro” αναστροφή της αντιφλεγμονώδους δράσης των γλυκοκορτικοειδών, η χημειοτακτική στρατολόγηση των μονοκυττάρων, η επαγωγή της παραγωγής IL-8 και TNF-α από μακροφάγα, η παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου από τα ουδετερόφιλα και η αυξορύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών του εξωκυττάριου χώρου MMP-1 και MMP-3 σε ινοβλάστες αρθρικού υμένα, έχουν συνδεθεί με τις ασυνήθιστες ενζυμικές ιδιότητές του, τις δραστικότητες της ταυτομεράσης και οξειδοαναγωγάσης που διαθέτει. Σκοπός: Στη παρούσα μελέτη διερευνάται η έκφραση των υπομονάδων του πρωτεασώματος στο πτερύγιο και η επίδραση της UV ακτινοβολίας στην έκφρασή τους σε ινοβλάστες πτερυγίου. Ιδιαίτερα δε, διερευνώνται η επίδραση της UVB ακτινοβολίας στην έκφραση και δραστικότητα της PSMB5 στις ινοβλάστες πτερυγίου και ο μηχανισμός μέσω του οποίου αυτή πραγματοποιείται. Επιπλέον, διερευνάται η παρουσία του MIF στο πτερύγιο, όπως επίσης, η έκφρασή του σε ινοβλάστες πτερυγίου καθώς και η εμπλοκή του στην έκφραση της PSMB5 στις ινοβλάστες αυτές υπό την επίδραση της UVB ακτινοβολίαςΜέθοδοιΦυσιολογικά δείγματα επιπεφυκότα και πτερυγίου ελήφθησαν από τον άνω-κροταφικό βολβικό επιπεφυκότα υγιών ατόμων που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση καταρράκτη και από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς ιστού πτερυγίου, αντίστοιχα. Οι ινοβλάστες απομονώθηκαν ύστερα από επεξεργασία των δειγμάτων με βακτηριακή κολλαγονάση. Η έκφραση των PSMB5, Nrf2 και MIF στους ιστούς και τα κύτταρα διαπιστώθηκε με ανάλυση RT-PCR και qPCR, και ανασοαποτύπωση western. Η κυτταρική επιβίωση μετρήθηκε με τη μέθοδο MTT και η δραστικότητα χυμοθρυψίνης του πρωτεασώματος προσδιορίστηκε με φθορισμομετρία. Τα επίπεδα του MIF στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων προσδιορίσθηκαν με τη μέθοδο ELISA και η ταυτοποίησή του σ’ αυτά πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ανασοαποτύπωσης western.ΑποτελέσματαAνάλυση RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση όλων των υπομονάδων του πρωτεασώματος ήταν σημαντικά χαμηλότερη στο πτερύγιο συγκριτικά με το φυσιολογικό επιπεφυκότα. Μετά την έκθεση σε UV (UVA και UVB) ακτινοβολία ινοβλαστών πτερυγίου παρατηρήθηκε καταστολή της έκφρασής τους. Με τη χρήση του ενεργοποιητή του Νrf2, Oltipraz, δείχτηκε ότι η έκφραση της PSMB5 διαμεσολαβείται από το μονοπάτι Nrf2/ARE. Η έκφραση των PSMB5 και Nrf2 σε ινοβλάστες πτερυγίου κατεστάλλει κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο μετά από έκθεση σε UVB ακτινοβολία με δόσεις 0–50 mJ/cm2. Η έκφραση της PSMB5, αλλά όχι του Nrf2, παρέμεινε σχεδόν στα επίπεδα ελέγχου, όταν η έκθεση σε UVB πραγματοποιήθηκε μετά από την προ-επώαση των κυττάρων με τον αναστολέα των src κινασών PP2, που υποδεικνύει ότι κάποια src κινάση εμπλέκεται στη καταστολή της PSMB5 που προκαλείται από τη UVB ακτινοβολία. Η UVB ακτινοβολία είχε το ίδιο αποτέλεσμα, αλλά σε μικρότερο βαθμό, στην έκφραση της PSMB5 σε φυσιολογικούς ινοβλάστες του επιπεφυκότα, υποδεικνύοντας ότι η παρατηρούμενη επίδραση της UVB ακτινοβολίας στις ινοβλάστες πτερυγίου δεν ήταν αποτέλεσμα εκφυλισμού των κυττάρων αυτών λόγω της ακτινοβολίας. Η UVB ακτινοβολία είχε πολύ μικρή επιβλαβή επίδραση στην επιβίωση των ινοβλαστών, ενώ δεν επηρέασε τη δραστικότητα χυμοθρυψίνης του πρωτεασώματος. Aνάλυση RT-PCR έδειξε επίσης ότι η έκφραση του MIF ήταν υψηλότερη στο πτερύγιο συγκριτικά με το φυσιολογικό επιπεφυκότα. Μετά την έκθεση ινοβλαστών πτερυγίου σε δόσεις UVB ακτινοβολίας 0-50 mJ/cm2, παρατηρήθηκε μια δοσοεξαρτώμενη από την ακτινοβολία επαγωγή της έκφρασης και της απελευθέρωσης του MIF στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων. Αντίθετα, η ακτινοβολία UVB δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του MIF σε φυσιολογικές ινοβλάστες του επιπεφυκότα. Η έκφραση της PSMB5 παρέμεινε σχεδόν στα επίπεδα ελέγχου, όταν η έκθεση στην UVB ακτινοβολία πραγματοποιήθηκε μετά την προ-επώαση των κυττάρων με τον αναστολέα του MIF ISO- 1, υποδεικνύοντας ότι ο MIF μπορεί να εμπλέκεται στην καταστολή της PSMB5 που προκλήθηκε από την ακτινοβολία. Συμπεράσματα: Φαίνεται ότι η UVB ακτινοβολία διεγείρει την έκφραση του MIF σε ινοβλάστες πτερυγίου, που με τη σειρά του, δρώντας αυτοκρινώς, οδηγεί σε μειορύθμιση της διαμεσολαβούμενης από το μονοπάτι Νrf2/ARE έκφρασης της PSMB5, μέσω κάποιας (ων) src κινάσης (ών), της οποίας διεγείρει την έκφραση ή την ενεργοποίηση. Είναι γνωστό ότι ο MIF μπορεί να επάγει την έκφραση διαφόρων παραγόντων, όπως κυτταροκινών και ενζύμων, καθώς και ότι το πρωτεάσωμα εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων παραγόντων, όπως μεταλοπρωτεϊνασών και των ενδογενών αναστολέων τους, κυτταροκινών και κολλαγόνων, τα οποία μπορούν να συμβάλουν στο σχηματισμό και την ανάπτυξη του πτερυγίου. Κατά συνέπεια, είναι εύλογο να διατυπωθεί η άποψη ότι η επίπτωση της UVB ακτινοβολίας στην παθογένεια του πτερυγίου διαμεσολαβείται εν μέρει από την αυξορύθμιση της έκφρασης του MIF και την επακόλουθη καταστολή της έκφρασης του πρωτεασώματος.