Ανάπτυξη μεθόδων για την in vivo ποσοτικοποίηση της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στους οργανισμούς

Abstract

The study presents a new method that detects O2•−, via quantification of 2-hydroxyethidium (2- ΟΗ-Ε+) as low as ~30 fmoles by High-Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC). The method isolates 2-ΟΗ-Ε+ after its extraction by the anionic detergent SDS (at 18-fold higher than its CMC; Critical Micelle Concentration) together with certain organic/inorganic reagents, and its HPTLC-separation from di-ethidium (di-Ε+) and ethidium (Ε+). Quantification of 2-OH-E+ is based on its ex/em maxima at 290/540 nm, and of di-E+ and E+ at 295/545 nm. The major innovations of the present method are the development of protocols for (i) efficient extraction (by SDS) and (ii) sensitive quantification (by HPTLC) for 2-OH-E+ (as well as di-E+ and E+) from most biological systems (animals, plants, cells, subcellular compartments, fluids). The method extracts 2-ΟΗ-Ε+ (by neutralizing the strong binding between its quaternary N+ and negatively charged sites on phospholipids, DNA etc.) together with free HE, while protects both from biological oxidases, and also extracts/quantifies total proteins (hydrophilic and hydrophobic) for expressing O2•− levels per protein quantity. The method also uses SDS (at 80- fold lower than its CMC) to extract/remove/wash 2-ΟΗ-Ε+ from cell/organelle exterior membrane sites, for more accurate internal content quantification. The new method is applied on indicative biological systems: (1) artificially stressed (mouse organs and liver mitochondria and nuclei, ±exposed to paraquat, a known O2•− generator), and (2) physiologically stressed (cauliflower plant, exposed to light/dark).

Η μελέτη παρουσιάζει μια νέα μέθοδο που εντοπίζει την ελεύθερη ρίζα O2•−, μέσω ποσοτικοποίησης του 2-υδροξυεθιδίου (2-ΟΗ-Ε+), με ευαισθησία ~30 fmoles με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (High-Performance Thin Layer Chromatography/ΗPTLC). Η μέθοδος απομονώνει το 2-ΟΗ-Ε+ μετά από την εκχύλισή του με το ανιονικό απορρυπαντικό SDS (σε συγκέντρωση 18 φορές μεγαλύτερη από τη κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση) μαζί με συγκεκριμένα οργανικά/ανόργανα αντιδραστήρια, και το διαχωρισμό του από τα μόρια εθίδιο (Ε+) και διεθίδιο (di-Ε+), μέσω της HPTLC. Η ποσοτικοποίηση του 2-ΟΗ-Ε+ βασίζεται στα μέγιστα ex/em στα 290/540 nm, και για τα E+ και di-E+ στα 295/545 nm. Οι πιο σημαντικές καινοτομίες της παρούσας μεθόδου είναι η ανάπτυξη πρωτοκόλλων για (α) την αποτελεσματική εκχύλιση (με το SDS) και (β) την ευαίσθητη ποσοτικοποίηση (με την HPTLC) του 2-OH-E+ (καθώς και των E+ και di-E+) από τα περισσότερα βιολογικά συστήματα (ζώα, φυτά, κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια, υγρά). Η μέθοδος εκχυλίζει το 2-ΟΗ-Ε+ (εξουδετερώνοντας τους ισχυρούς δεσμούς μεταξύ των τεταρτοταγών τους N+ και των αρνητικά φορτισμένων ομάδων στα φωσφολιπίδια, το DNA κ.λπ.) μαζί με το υδροεθίδιο (HE), προστατεύει και τα δύο μόρια από βιολογικές οξειδάσες, ενώ εκχυλίζει/ποσοτικοποιεί τις ολικές πρωτεΐνες (υδρόφιλες/υδρόφοβες) για να εκφράζονται τα επίπεδα της ελεύθερης ρίζας O2•− ανά βάρος πρωτεΐνης. Επίσης, η μέθοδος χρησιμοποιεί επίσης το SDS (σε συγκέντρωση 80 φορές μικρότερη από τη CMC) για να εκχυλίσει/απομακρύνει/πλύνει το 2-ΟΗ-Ε+ από την εξωτερική μεμβράνη κυττάρων/οργανιδίων και έτσι να ποσοτικοποιείται με ακρίβεια το εσωτερικό περιεχόμενο του 2-ΟΗ-Ε+. Η νέα μέθοδος εφαρμόστηκε σε ενδεικτικά βιολογικά συστήματα, στα οποία η πρόκληση του οξειδωτικού stress (καταπόνηση) έγινε: (1) με τεχνητό τρόπο μέσω της χορήγησης σε ποντικούς της ουσίας paraquat, η οποία είναι γνωστή για τις οξειδωτικές ιδιότητες και την επαγωγή ελευθέρων ριζών, και (2) με φυσιολογικό τρόπο σε φύλλα κουνουπιδιού μέσω της έκθεσής τους σε φως.