Επίδραση της επαγόμενης από σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt-1, πρωτεϊνης-1 (Wisp-1) στην έκφραση του παράγοντα αναστολής της μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) σε ινοβλάστες από ασθενείς με διάφορες νόσους του συνδετικού ιστού και ο ρόλος της στην παθογένεια των νόσων αυτών

Abstract

Introduction: Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative disease of the synovial joint, including the degradation of articular cartilage, subchondral bone sclerosis, abnormal bone remodeling, osteophyte formation, and chronic inflammation of the synovial membrane. The exact etiology of OA is not well understood. The synovial membrane is responsible for the inflammatory reaction leading to macrophage derived proinflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α, that promote inflammation, neovascularization and cartilage degradation via activation of proteolytic enzymes, such as matrix metalloproteinases (MMPs). The principal forms of OA treatment include pain management and replacement surgery (total arthroplasty). However, eight to ten years after the total arthroplasty, loosening of inserted prostheses is usually observed. A cascade of mechanical and biological events take place, involving the fragmentation and wear of the implanted materials and subsequently the release of implant particles into the periprosthetic tissues, evoking a foreign-body reaction and activation of cells to produce a variety of cytokines, growth factors and proteolytic enzymes. These cell products cause, through complex mechanisms, periprosthetic osteolysis that exceeds the reparative capacity of the fibrous and osseous tissues, resulting in loosening of the implant. Pterygium is an eye disorder featuring hyperplasia of the cornea epithelium, overgrowth of stromal fibroblasts and blood vessels, significant neovascularization, inflammatory cell infiltration and abnormal extracellular matrix accumulation, with elastin and collagen to be the main components. Histopathological studies revealed that the pterygium epithelium, which invades the cornea, exhibits alterations such as squamous metaplasia and goblet cell overgrowth. The exactly reasons of pterygium pathogenesis remain unclear, however the ultraviolet (UV) radiation is considered to be the most acceptable reason of initiation of this disorder. Nasal polyposis (NP) is a chronic inflammatory disease of the upper airways, featuring inflammatory cell infiltration, modifications of epithelial differentiation, and tissue remodeling, including basement membrane thickening, gland modifications, extracellular matrix (ECM) accumulation and oedema. It has been reported that polyp formation involves ECM swelling through an initial localized epithelial injury. Interactions between epithelial, stromal and inflammatory cells could then perpetuate further polyp growth. Mucosal inflammation, especially containing an infiltration of eosinophils, is probably the most important factor in the development of nasal polyposis. Various mediators, including cytokines, chemokines, growth factors, adhesion molecules and proteolytic enzymes are found in pterygium and polyp stroma, and some of these mediators participate in a series of events that culminate in chronic inflammation and the subsequent development of these diseases. The lung is the primary organ of the respiratory system, composed of specialized cell types that provide structure and perform the necessary tasks for the lung to function properly. Every day, together with breath air, airborne particles are entered that can injure the lung, which in many cases do not come out again during exhalation. In healthy conditions, these threats do not necessarily cause a problem due to the fact that the lung has evolved to balance responses to maintain homeostasis, whereby it responds efficiently to threats without causing an exaggerated response that hampers the respiratory process. However, when the threat becomes repetitive and/or when the conditions alter basic cell functions (e.g., aging, genetic predispositions, immune disorders), the response of the lung to tissue damage becomes distorted and may lead to several chronic lung diseases, including COPD, asthma, pulmonary fibrosis, lung cancer, and pulmonary hypertension.Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is characterized by formation of fibroblast foci and deposition of extracellular matrix (ECM) in the lung interstitium. This results in distorted lung architecture, impaired gas exchange and reduced respiratory function. Impaired crosstalk between alveolar type 11 (AT11) cells and subepithelial fibroblasts has previously been shown to contribute to ECM deposition in IPF.COPD is one of the most common chronic lung diseases, and, according to the World Health Organization (WHO), is the fourth cause of death worldwide. The primary cause of COPD is exposure to cigarette smoke and/or air pollution. The pathogenesis of COPD develops as an exaggerated inflammation in response to cell damage caused by the repetitive exposure to toxic components such as those found in cigarette smoke or air pollution. Exposure of lung epithelial cells to these toxic agents leads to epithelial cell injury. Because of the repetitive nature of the toxic exposure, persistent inflammatory and repair responses may occur, leading to the overall destruction of lung tissue, known as emphysema, and to airway fibrosis associated with chronic bronchitis.Asthma is a chronic inflammatory disease, affecting children and adults, characterized by airway obstruction and bronchial hyperresponsiveness. Asthma is thought to develop as a complex gene-environment interaction in response to allergens, pollutants, microbes, and/or oxidative stress. All the different endotypes of asthma are characterized by airway hyperresponsiveness, a consequence of immune and physiological responses to allergens or pollutants. The immune response may include activation of eosinophils, neutrophils, dendritic cells, macrophages, mast cells, and CD4 positive T cells. Another distinctive pathophysiological feature of asthma is airway remodeling, characterized by thickening of the basement membrane, an increase in airway smooth muscle mass, bronchial epithelium damage and cilial dysfunction, goblet cell hyperplasia, and increased mucus production.Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a conserved protein found across eukaryotes, which in mammals is known by its function as a pleiotropic cytokine. Unlike most cytokines, MIF has enzymatic activity as a phenylpyruvate tautomerase and D-dopachrome tautomerase (DDT). MIF has been shown to be involved in a wide range of diseases such as cancer, atherosclerosis, diabetes, and several inflammatory conditions. MIF induces a wide range of effects by different modes of action. Its function is mostly proinflammatory with chemokine-like properties via binding and activation of complex CD74/CD44 receptors found in a variety of tissues, initiating cytokine release and cell proliferation. MIF has a significant role in the innate immune defense against acute viral and bacterial infection, tuberculosis, and protozoan diseases. In addition to these functions, MIF has a unique feature by its induction by glucocorticoids, in which MIF is one of a few mediators with the ability to antagonize the anti-inflammatory effect of glucocorticoids.MIF has been identified in RA and OA fluid, serum and synovial fibroblasts. It has been demonstrated in vitro induction by MIF of molecules and processes relevant to RA and OA, including FLS proliferation and expression of pro-inflammatory genes including phospholipase A2, cyclooxygenase-2, prostaglandin E2 TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 and IL-8. In addition, MIF up-regulates MMP-1 and MMP-3 expression in synovial FLS in vitro and these molecules are important in tissue remodeling and may be crucial to cartilage injury. MIF has been also identified in nasal polyp and eye pterygium.MIF has been associated with several chronic lung diseases, including COPD, asthma, pulmonary fibrosis, lung cancer, and pulmonary hypertension. In the lungs, MIF can be found in macrophages, lymphocytes, eosinophils, and the capillary endothelium. Increased MIF levels have been measured in both bronchial alveolar lavage and serum in patients with asthma. Raised MIF values has also been observed in acute respiratory distress syndrome (ARDS), obstructive sleep apnea, and idiopathic pulmonary fibrosis. The activated β-catenin, through Wnt canonical pathway, directly promotes the transcription of a variety of Wnt/β-catenin signaling effectors, including WNT1-inducible signaling pathway protein 1 (WISP1/CCN4). WISP-1/CCN4 is a secreted matricellular protein that belongs to the CCN family. Except for WISP-2, all CCN proteins contain a short N-terminal signal peptide, followed by four conserved structural domains (IGFBP, VWC, TSP, and CT) to mediate their interactions with extracellular proteins and cell surface receptors. WISP-1do not interact with specific membrane receptors, but it binds multiligand receptors, primarily integrins, to regulate the intracellular signaling. WISP-1 is able to activate a variety of downstream signaling, including focal adhesion kinase (FAK), RAS/RAF/MEK/ERK, NF-κB, TGF-β, and PI3K/AKT pathways. Functionally, WISP-1-initiated signals regulate various biological processes, including cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, motility, and wound healing/tissue repair. In vitro binding assays and functional assays with integrin blocking antibodies indicated that α5β1, αvβ3, and αvβ5 integrins were involved in WISP-1 signaling, and these integrins were essential for WISP-1-induced activation of FAK, Rac, RAS/RAF/MEK/ERK, JNK, or NF-κB pathways in epithelial cells, fibroblasts, bone marrow stromal cells, or cancer cells. It has been previously demonstrated that WISP-1 is implicated in OA pathogenesis, as well as in lung diseases, including COPD, asthma and pulmonary fibrosis. On the other hand, there are not evidences regarding the implication of WISP1 in arthroplasty endoprostheses loosening, nasal polyp and pterygium. In addition, there are not also evidences about the association of WISP-1 with MIF and vice-versa.AimThe aim of the present work is the study of the Wnt-1 / WISP-1 signaling pathway and its ability to induce the expression of MIF and various other extracellular matrix molecules, such as cytokines and proteolytic enzymes in primary cultures of fibroblasts from synovial membrane (SM) of patients with osteoarthritis, periprosthetic membrane from loose arthroplasty endoprostheses (IFT), nasal polyp (NP), eye pterygium (EP) and normal lung fibroblasts (NL).MethodsFibroblasts were isolated from SM, IFT, NP, EP and NL tissues upon mild treatment with clostridium collagenase. The cells were cultured in DMEM with WISP-1, in the absence or presence of several inhibitors and other factors tested. In all the experiments, fibroblasts of at least 4th passage were used. The techniques used were ELISA, western blotting, qPCR and immunohistochemistry. Results It has been previously reported that WISP-1 and MIF is highly expressed in SM from patients with OA, as well as in the lung of patients with various lung diseases, such as IPF, COPD and asthma, and may be implicated in the pathogenesis of these disorders. In addition, it was known that MIF is also expressed in IFT, nasal polyp and pterygium. Using qPCR and western blotting it was ascertain that WISP-1is present also in IFT, nasal polyp and pterygium.Immunohistochemistry study, using specific antibodies against human WISP-1and MIF, revealed that both, WISP-1 and MIF are highly co-expressed in epithelial cells of SM, nasal polyp and pterygium, and in giant cells in IFT. Immunostaining for MIF was also observed in stromal cells of all tissues tested. Treatment of fibroblasts with WISP-1 at various concentrations enhanced MIF production in a concentration- and time-dependent fashion. In WISP-1-enhanced MIF production the αvβ5 integrin and dermatan sulphate proteoglycans, as well as the MAP kinases, PI3-K/Akt, PKC, FAK, cAMP/EPAC and NF-κB signalling pathways are involved. WISP-1-enhanced MIF expression was also attenuated in the presence of the src-kinase inhibitor PP2 or in the presence of ISO-1, an inhibitor of MIF tautomerase activity. It was also found that WISP-1-enhanced MIF expression involves EGFR after its transactivation by src kinases, which are previously activated by the effect of WISP-1.WISP-1 was also able to enhance the expression of CD74 and CD44, through of which MIF exerts its effects on cells. In addition, it was ascertain that WISP-1 was also able to promote the cells migration and to enhance the expression of IL-6, of COX-2 and PGE2 production, and the production of matrix metalloproteinases, MMP-1, MMP-2, MMP-3 and MT1-MMP. These effects of WISP-1 are mediated by MIF, as shown. Quercetin, an isoflavone with antioxidant properties, was able to suppress the WISP-1-enhanced expression of both MIF and IL-6. ConclusionsIt appear that, WISP-1, in addition of its implication in pathogenesis of OA and various lung diseases, may be also implicated in the pathogenesis of arthroplasty loosening, nasal polyp and eye pterygium, which it is reported for the first time. WISP-1, by the mediation of various factors, mainly of integrin αvβ5, FAK/src kinases, EGFR, PKC and NF-κB, up-regulates the expression of MIF in a variety of fibroblasts of different origin. MIF then, through the complex of its receptor/co-receptor, CD74/CD44, activates src kinases. The src kinases can also be activated by PGE2, the production of which is enhanced by MIF. Thereafter, src kinases trans-activate EGFR leading in the enhancement of expression of MIF itself and IL-6, as well as in the enhancement of MMPs production.To be concluded, the implication of WISP-1 in pathogenesis of several diseases, such as, OA, arthroplasty loosening, nasal polyp, eye pterygium and lung diseases may be mediated at least in part by MIF of which the expression it enhances.

Εισαγωγή: Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) είναι η πιο συχνή εκφυλιστική νόσος της αρθρικής άρθρωσης, που περιλαμβάνει την αποικοδόμηση του αρθρικού χόνδρου, την πάχυνση του υποχόνδριου οστού, την ανώμαλη παραγωγή οστίτη ιστού, τον σχηματισμό οστεοφύτων και τη χρόνια φλεγμονή του αρθρικού υμένα. Η ακριβής αιτιολογία της ΟΑ δεν είναι πλήρως κατανοητή. Ο αρθρικός υμένας είναι υπεύθυνος για τη φλεγμονώδη αντίδραση που οδηγεί σε παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών προερχόμενων από τα μακροφάγα, όπως οι IL-1β, IL-6, IL-8 και TNF-α, οι οποίες προάγουν τη φλεγμονή, τη νεοαγγείωση και την αποδόμηση του χόνδρου μέσω της ενεργοποίησης πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου (MMPs). Οι κύριες μορφές θεραπείας της ΟΑ περιλαμβάνουν τη διαχείριση του πόνου και τη χειρουργική επέμβαση αντικατάστασης της άρθρωσης (ολική αρθροπλαστική). Ωστόσο, οκτώ έως δέκα χρόνια μετά την ολική αρθροπλαστική, παρατηρείται συνήθως χαλάρωση των εισαγόμενων προθέσεων. Λαμβάνει χώρα ένας καταρράκτης μηχανικών και βιολογικών γεγονότων, που περιλαμβάνει τον κατακερματισμό και τη φθορά των εμφυτευμένων υλικών και στη συνέχεια την απελευθέρωση σωματιδίων του εμφυτεύματος στους περιπροσθετικούς ιστούς, προκαλώντας αντίδραση ξένου σώματος και ενεργοποίηση των κυττάρων για την παραγωγή ποικίλων κυτταροκινών, αυξητικών παραγόντων και πρωτεολυτικών ενζύμων. Αυτά τα κυτταρικά προϊόντα προκαλούν, μέσω πολύπλοκων μηχανισμών, περιπροσθετική οστεόλυση που υπερβαίνει την ικανότητα αποκατάστασης του ινώδους και του οστίτη ιστού, με αποτέλεσμα τη χαλάρωση των εμφυτευμάτων. Το πτερύγιο είναι μια οφθαλμική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από υπερπλασία του επιθηλίου του κερατοειδούς, υπερανάπτυξη ινοβλαστών του στρώματος και αιμοφόρων αγγείων, σημαντική νεοαγγείωση, διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και ανώμαλη συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού με κύρια συστατικά την ελαστίνη και το κολλαγόνο. Ιστοπαθολογικές μελέτες αποκάλυψαν ότι το επιθήλιο του πτερυγίου, το οποίο εισβάλλει στον κερατοειδή, παρουσιάζει αλλοιώσεις, όπως πλακώδη μεταπλασία και υπερανάπτυξη κυττάρων των βλεννογόνων. Οι ακριβείς λόγοι της παθογένειας του πτερυγίου παραμένουν ασαφείς, ωστόσο η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) θεωρείται ο πιο αποδεκτός λόγος έναρξης αυτής της διαταραχής. Ο ρινικός πολύποδας (NP) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος των ανώτερων αναπνευστικών οδών, που χαρακτηρίζεται από φλεγμονώδη διήθηση κυττάρων, τροποποιήσεις της επιθηλιακής διαφοροποίησης και αναδιαμόρφωση των ιστών, συμπεριλαμβανομένων της πάχυνσης της βασικής μεμβράνης, τροποποιήσεων των αδένων, συσσώρευσης εξωκυττάριου υλικού και οιδήματος. Έχει αναφερθεί ότι ο σχηματισμός πολυπόδων περιλαμβάνει διόγκωση του εξωκυτταρικού χώρου μέσω ενός αρχικού εντοπισμένου επιθηλιακού τραυματισμού. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ επιθηλιακών, στρωματικών και φλεγμονωδών κυττάρων θα μπορούσαν στη συνέχεια να διαιωνίσουν την περαιτέρω ανάπτυξη του πολύποδα. Η φλεγμονή του βλεννογόνου, που χαρακτηρίζεται ιδιαίτερα από διήθηση ηωσινόφιλων, είναι πιθανώς ο σημαντικότερος παράγοντας στην ανάπτυξη ρινικού πολύποδα. Διάφοροι μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένων κυτταροκινών, χημειοκινών, αυξητικών παραγόντων, μορίων προσκόλλησης και πρωτεολυτικών ενζύμων βρίσκονται στο στρώμα του πτερυγίου και του πολύποδα και ορισμένοι από αυτούς τους μεσολαβητές συμμετέχουν σε μια σειρά γεγονότων που καταλήγουν σε χρόνια φλεγμονή και στην επακόλουθη ανάπτυξη αυτών των ασθενειών. Ο πνεύμονας είναι το κυριότερο όργανο του αναπνευστικού συστήματος το οποίο αποτελείται από εξειδικευμένους τύπους κυττάρων που παρέχουν δομή και είναι υπεύθυνα για τη σωστή λειτουργία του πνεύμονα. Καθημερινά αναπνέουμε οξυγόνο του αέρα αλλά μαζί εισέρχονται και αερομεταφερόμενα σωματίδια που μπορούν να τραυματίσουν τον πνεύμονα, τα οποία σε πολλές περιπτώσεις δεν εξέρχονται ξανά κατά την εκπνοή. Σε υγιείς συνθήκες, αυτές οι απειλές δεν προκαλούν απαραίτητα πρόβλημα λόγω του γεγονότος ότι ο πνεύμονας έχει εξελιχθεί να εξισορροπεί τις αντιδράσεις για τη διατήρηση της ομοιόστασης, με αποτέλεσμα να ανταποκρίνεται αποτελεσματικά στις απειλές χωρίς να προκαλεί υπερβολική αντίδραση που εμποδίζει την αναπνευστική διαδικασία. Ωστόσο, όταν η απειλή γίνεται επαναλαμβανόμενη και/ή όταν οι συνθήκες μεταβάλλουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες (π.χ. γήρανση, γενετικές προδιαθέσεις, ανοσολογικές διαταραχές), η απόκριση του πνεύμονα στην ιστική βλάβη διαστρεβλώνεται και μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες χρόνιες πνευμονικές παθήσεις, όπως η ΧΑΠ, το άσθμα, η πνευμονική ίνωση, ο καρκίνος του πνεύμονα και η πνευμονική υπέρταση.Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF) χαρακτηρίζεται από σχηματισμό εστιών ινοβλαστών και εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας (ECM) στο διάμεσο χώρο του πνεύμονα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη παραμόρφωση της αρχιτεκτονικής των πνευμόνων, την διαταραγμένη ανταλλαγή αερίων με επακόλουθο την μείωση της αναπνευστικής λειτουργίας. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι η διαταραχή της ενδοεπικοινωνίας μεταξύ κυψελιδικών κυττάρων τύπου ΙΙ (ATII) και υπο-επιθηλιακών ινοβλαστών συμβάλλει στην εναπόθεση ECM στην IPF.Η ΧΑΠ είναι μία από τις πιο συχνές χρόνιες πνευμονοπάθειες και, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ), αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου παγκοσμίως. Η κύρια αιτία της ΧΑΠ είναι η έκθεση στον καπνό του τσιγάρου ή/και στην ατμοσφαιρική ρύπανση. Η παθογένεια της ΧΑΠ αναπτύσσεται ως μια υπερβολική φλεγμονή ως απάντηση σε κυτταρική βλάβη που προκαλείται από την επαναλαμβανόμενη έκθεση σε τοξικά συστατικά, όπως αυτά που βρίσκονται στον καπνό του τσιγάρου ή στην ατμοσφαιρική ρύπανση. Η έκθεση των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα σε αυτούς τους τοξικούς παράγοντες οδηγεί σε τραυματισμό των επιθηλιακών κυττάρων. Λόγω της επαναλαμβανόμενης φύσης της τοξικής έκθεσης, μπορεί να εμφανιστούν επίμονες φλεγμονώδεις και επιδιορθωτικές αντιδράσεις, οι οποίες οδηγούν στη συνολική καταστροφή του πνευμονικού ιστού, γνωστή ως εμφύσημα, και στην ίνωση των αεραγωγών που σχετίζεται με τη χρόνια βρογχίτιδα.Το άσθμα είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος, που προσβάλλει παιδιά και ενήλικες και χαρακτηρίζεται από απόφραξη των αεραγωγών και βρογχική υπεραντιδραστικότητα. Θεωρείται ότι το άσθμα αναπτύσσεται ως μια σύνθετη αλληλεπίδραση γονιδίου-περιβάλλοντος σε απόκριση σε αλλεργιογόνα, ρύπους, μικρόβια και/ή οξειδωτικό στρες. Όλοι οι διαφορετικοί ενδότυποι του άσθματος χαρακτηρίζονται από υπερ-αντιδραστικότητα των αεραγωγών, συνέπεια ανοσολογικών και φυσιολογικών αποκρίσεων σε αλλεργιογόνα ή ρύπους. Η ανοσολογική απόκριση μπορεί να περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ηωσινόφιλων, ουδετερόφιλων, δενδριτικών κυττάρων, μακροφάγων, σιτευτικών κυττάρων και CD4 θετικών Τ βοηθητικών κυττάρων. Ένα άλλο ιδιαίτερο παθοφυσιολογικό χαρακτηριστικό του άσθματος είναι η αναδιαμόρφωση των αεραγωγών, που χαρακτηρίζεται από πάχυνση της βασικής μεμβράνης, αύξηση της μάζας των λείων μυών των αεραγωγών, βλάβη του βρογχικού επιθηλίου και δυσλειτουργία των βλεννογόνων, υπερπλασία των κυττάρων των βλεννογόνων και αυξημένη παραγωγή βλέννας.Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF) είναι μια καλά συντηρημένη πρωτεΐνη που απαντάται σε όλους τους ευκαρυώτες, η οποία στα θηλαστικά είναι γνωστή από τη λειτουργία της ως πλειοτροπική κυτταροκίνη. Σε αντίθεση με τις περισσότερες κυτταροκίνες, ο MIF έχει ενζυμική δραστικότητα ταυτομεράσης του φαινυλο-πυροσταφυλικού και ταυτομεράσης του D-ντοπαχρώματος (DDT). Ο MIF έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, όπως ο καρκίνος, η αθηροσκλήρωση, ο διαβήτης και διάφορες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Ο MIF προκαλεί ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων με διαφορετικούς τρόπους δράσης. Η λειτουργία του είναι ως επί το πλείστο προφλεγμονώδης με ιδιότητες που ομοιάζουν με χημειοκίνες, μέσω της πρόσδεσης και ενεργοποίησης του συμπλόκου υποδοχέων CD74/CD44 που βρίσκονται σε διάφορους ιστούς, οδηγώντας στην απελευθέρωση κυτταροκινών και στο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ο MIF έχει σημαντικό ρόλο στην άμυνα μέσω της έμφυτης ανοσίας έναντι οξείας ιογενούς και βακτηριακής λοίμωξης, φυματίωσης και πρωτοζωϊκών ασθενειών. Εκτός από αυτές τις λειτουργίες, ο MIF έχει ένα μοναδικό χαρακτηριστικό, από τη μια μεριά η έκφρασή του επάγεται από τα γλυκοκορτικοειδή, και από την άλλη είναι ένας από τους λίγους μεσολαβητές με την ικανότητα να ανταγωνίζεται την αντιφλεγμονώδη δράση των γλυκοκορτικοειδών.Ο MIF έχει εντοπιστεί στο αρθρικό υγρό ασθενών με ΡΑ και ΟΑ, στον ορό και στους αρθρικούς ινοβλάστες. Έχει αποδειχθεί in vitro η επαγωγή από τον MIF μορίων και διεργασιών σχετικών με τη ΡΑ και την ΟΑ, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των FLS και της έκφρασης προφλεγμονωδών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της φωσφολιπάσης Α2, της κυκλοοξυγενάσης-2, της προσταγλανδίνης Ε2, του TNF-α, της IL-1β, της IL-2, της IL-6 και της IL-8. Επιπλέον, ο MIF ρυθμίζει την έκφραση των MMP-1 και MMP-3 σε FLS in vitro και αυτά τα μόρια είναι σημαντικά για την αναδιαμόρφωση των ιστών και μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τον τραυματισμό του χόνδρου. Ο MIF έχει επίσης ταυτοποιηθεί σε ρινικό πολύποδα και πτερύγιο οφθαλμού.Ο MIF έχει συσχετιστεί με διάφορες χρόνιες πνευμονοπάθειες, όπως η ΧΑΠ, το άσθμα, η πνευμονική ίνωση, ο καρκίνος του πνεύμονα και η πνευμονική υπέρταση. Στους πνεύμονες, ο MIF απαντάται σε μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, ηωσινόφιλα και στο ενδοθήλιο των τριχοειδών. Αυξημένα επίπεδα MIF έχουν μετρηθεί τόσο στο βρογχικό κυψελιδικό έκπλυμα όσο και στον ορό σε ασθενείς με άσθμα. Αυξημένες τιμές MIF έχουν επίσης παρατηρηθεί στο σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS), στην αποφρακτική άπνοια ύπνου και στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Η ενεργοποιημένη β-κατενίνη, μέσω της κανονικής οδού Wnt, προάγει άμεσα τη μεταγραφή μιας ποικιλίας Wnt/β-κατενίνης εξαρτώμενων δραστικών σηματοδοτικών μορίων, συμπεριλαμβανομένης της επαγόμενης από το σηματοδοτικό μονοπάτι WNT1 πρωτεΐνη-1 (WISP-1/CCN4). Η WISP-1/CCN4 είναι μια εκκρινόμενη μητροκυτταρική (matricellular) πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια CCN. Εκτός από την WISP-2, όλες οι πρωτεΐνες CCN περιέχουν ένα μικρό Ν-τελικό σηματοδοτικό πεπτίδιο, ακολουθούμενο από τέσσερις συντηρημένες δομικές περιοχές (IGFBP, VWC, TSP και CT) για τη διαμεσολάβηση των αλληλεπιδράσεών τους με εξωκυτταρικές πρωτεΐνες και υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας. Η WISP-1 δεν αλληλοεπιδρά με συγκεκριμένους μεμβρανικούς υποδοχείς, αλλά δεσμεύει πολυμερείς υποδοχείς, κυρίως ιντεγκρίνες, για να ρυθμίσει την ενδοκυτταρική σηματοδότηση. Η WISP-1 είναι σε θέση να ενεργοποιήσει μια ποικιλία καθοδικών σηματοδοτικών οδών, συμπεριλαμβανομένων των οδών της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (FAK), RAS/RAF/MEK/ERK, NF-κB, TGF-β και PI3K/Akt. Λειτουργικά, τα σήματα που πυροδοτούνται από το WISP-1, ρυθμίζουν διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής προσκόλλησης, του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της επιβίωσης, της κινητικότητας και της επούλωσης πληγών/επισκευής ιστών. Δοκιμές πρόσδεσης in vitro και λειτουργικές δοκιμές με αντισώματα δέσμευσης ιντεγκρινών υπέδειξαν ότι οι α5β1, αvβ3 και αvβ5 ιντεγκρίνες εμπλέκονται στη σηματοδότηση της WISP-1 και οι ιντεγκρίνες αυτές ήταν απαραίτητες για την επαγόμενη από WISP-1 ενεργοποίηση των μονοπατιών FAK, Rac, RAS/RAF/MEK/ERK, JNK ή NF-κB σε επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών ή καρκινικά κύτταρα.Έχει ήδη αποδειχθεί ότι η WISP-1 εμπλέκεται στην παθογένεια της ΟΑ, καθώς και σε πνευμονικές παθήσεις, όπως η ΧΑΠ, το άσθμα και η πνευμονική ίνωση. Από την άλλη πλευρά, δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με την εμπλοκή της WISP-1 στη χαλάρωση των ενδοπροθέσεων αρθροπλαστικής, στον ρινικό πολύποδα και στο πτερύγιο. Επιπλέον, δεν υπάρχουν επίσης στοιχεία σχετικά με τη συσχέτιση της WISP-1 με τον MIF και αντίστροφα.ΣτόχοςΣκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt-1 / WISP-1 και της ικανότητάς του να επάγει την έκφραση του MIF και διαφόρων άλλων μορίων της εξωκυττάριας ουσίας, όπως κυτταροκίνες και πρωτεολυτικά ένζυμα, σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από αρθρικό υμένα (SM) ασθενών με οστεοαρθρίτιδα, περιπροσθετική μεμβράνη από χαλαρές ενδοπροθέσεις αρθροπλαστικής (IFT), ρινικό πολύποδα (NP), πτερύγιο οφθαλμού (EP) και φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα (NL).ΜέθοδοιΑπομονώθηκαν ινοβλάστες από ιστούς SM, IFT, NP, EP και NL μετά από ήπια επεξεργασία με κλοστριδιακή κολλαγονάση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με WISP-1, απουσία ή παρουσία διαφόρων αναστολέων και άλλων παραγόντων που εξετάστηκαν. Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες τουλάχιστον 4ης γενιάς. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ELISA, western blotting, qPCR και ανοσοϊστοχημεία.Αποτελέσματα Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η WISP-1 και ο MIF εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό σε SM από ασθενείς με ΟΑ, καθώς και στους πνεύμονες ασθενών με διάφορες πνευμονικές παθήσεις, όπως η IPF, η ΧΑΠ και το άσθμα, και μπορεί να εμπλέκονται στην παθογένεια των διαταραχών αυτών. Επιπλέον, ήταν γνωστό ότι ο MIF εκφράζεται επίσης στην IFT, στο ρινικό πολύποδα και στο πτερύγιο. Χρησιμοποιώντας qPCR και ανοσοαποτύπωση western διαπιστώθηκε ότι η WISP-1απαντάται επίσης στην IFT, στον ρινικό πολύποδα και στο πτερύγιο.Ανοσοϊστοχημική μελέτη, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι ανθρώπινης WISP-1και MIF, αποκάλυψε ότι τόσο η WISP-1 όσο και ο MIF συν-εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στα επιθηλιακά κύτταρα της SM, του ρινικού πολύποδα και του πτερυγίου, καθώς και στα γιγαντοκύτταρα της IFT. Ανοσολογική χρώση για τον MIF παρατηρήθηκε επίσης σε στρωματικά κύτταρα όλων των ιστών που εξετάστηκαν. Η επεξεργασία ινοβλαστών με WISP-1 σε διάφορες συγκεντρώσεις, ενίσχυσε την παραγωγή MIF με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση και το χρόνο. Στην ενισχυόμενη από τη WISP-1 παραγωγή MIF εμπλέκονται η αvβ5 ιντεγκρίνη και οι πρωτεογλυκάνες της θ. δερματάνης, καθώς και τα σηματοδοτικά μονοπάτια των MAPΚ, PI3K/Akt, PKC, FAK, cAMP/EPAC και NF-κB. Η ενισχυόμενη από τη WISP-1 έκφραση του MIF μειώθηκε επίσης παρουσία του αναστολέα των src-κινασών PP2 ή παρουσία του ISO-1, ενός αναστολέα της δραστικότητας ταυτομεράσης του MIF. Διαπιστώθηκε επίσης ότι στην ενισχυόμενη από WISP-1 έκφραση του MIF εμπλέκεται ο EGFR μετά τη διενεργοποίησή του από src κινάσες, οι οποίες προηγουμένως ενεργοποιούνται από την επίδραση της WISP-1.Η WISP-1 ήταν επίσης σε θέση να ενισχύσει την έκφραση των CD74 και CD44, μέσω των οποίων ο MIF ασκεί τις επιδράσεις του στα κύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η WISP-1 ήταν επίσης σε θέση να προάγει τη μετανάστευση των κυττάρων και να ενισχύσει την έκφραση της IL-6, την έκφραση της COX-2 και τη παραγωγή PGE2, καθώς και τη παραγωγή των μεταλλοπρωτεϊνασών του εξωκυτταρικού χώρου, MMP-1, MMP-2, MMP-3 και MT1-MMP. Αυτές οι επιδράσεις της WISP-1 αποδείχθηκε ότι διαμεσολαβούνται από τον MIF.Η κερσετίνη, μια ισοφλαβόνη με αντιοξειδωτικές ιδιότητες, ήταν σε θέση να καταστείλει την ενισχυόμενη από τη WISP-1 έκφραση τόσο του MIF όσο και της IL-6. ΣυμπεράσματαΦαίνεται ότι, η WISP-1, εκτός από την εμπλοκή της στη παθογένεια της ΟΑ και διαφόρων πνευμονικών παθήσεων, μπορεί επίσης να εμπλέκεται στην παθογένεια της χαλάρωσης αρθροπλαστικής, του ρινικού πολύποδα και του πτερυγίου οφθαλμού, η οποία αναφέρεται για πρώτη φορά. Η WISP-1, με τη μεσολάβηση διαφόρων παραγόντων, κυρίως της ιντεγκρίνης αvβ5, των κινασών FAK/src, του EGFR, της PKC και του NF-κB, ρυθμίζει την έκφραση του MIF σε μια ποικιλία ινοβλαστών διαφορετικής προέλευσης. Ο MIF, μέσω του συμπλόκου του υποδοχέα/συνυποδοχέα του, CD74/CD44, ενεργοποιεί τις κινάσες src. Οι κινάσες src μπορούν επίσης να ενεργοποιηθούν με την PGE2, η παραγωγή της οποίας ενισχύεται από τον MIF. Στη συνέχεια, οι src-κινάσες διενεργοποιούν τον EGFR οδηγώντας στην ενίσχυση της έκφρασης του ίδιου του MIF και της IL-6, καθώς και στην ενίσχυση της παραγωγής MMPs.Συμπερασματικά, η εμπλοκή της WISP-1 στην παθογένεια διαφόρων ασθενειών, όπως η ΟΑ, η χαλάρωση αρθροπλαστικής, ο ρινικός πολύποδας, το πτερύγιο οφθαλμού και οι ασθένειες των πνευμόνων, μπορεί να διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από τον MIF, την έκφραση του οποίου ενισχύει.