Γενετική και μοριακή μελέτη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και συσχέτιση του με την αφυλετικότητα και την φυτοπαθογένεια στον αστομύκητα Verticillium dahllae

Abstract

The most common type of programmed cell death in filamentous fungi is the so-called heterokaryon (or vegetative) incompatibility, which is part of the nonself recognition system and restricts the spread of selfish parasitic elements in fungal populations. The parasexual cycle, which is initiated after hyphal and/or conidial anastomosis and is characterized by the heterokaryon formation, the co-existence of genetically different nuclei in the same cytoplasm, and finally the exchange of genetic material after nuclear fusion, formation of an unstable diploid nucleus, and subsequent haploidization process, is thought to be restricted by the incompatibility barriers. Appropriate complementation tests have classified isolates of different fungal species into Vegetative Compatibility Groups (VCGs) and is thought that only members of the same VCG can be implicated into parasexual interactions. The phenomenon of heterokaryon incompatibility has been studied in few model organisms, such as Neurospora crassa and Podospora anserina, and is controlled by several polymorphic loci termed as het genes. The aim of this study was the detailed characterization of the programmed cell death induced by heterokaryon incompatibility in the asexual phytopathogenic fungus V. dahliae and its relation with other programmed cell death pathways and the parasexual cycle.At first a functional analysis of the so-called Conidial Anastomosis Tubes (CATs) was performed, and it was observed that under nutrient limiting conditions CATs permit nuclear migration between ‘compatible’ strains. Further genetic analyses revealed that their formation is controlled by the conserved signaling pathways of the MAP kinases Fus3 and Slt2, as well as by NADPH oxidase A. Extensive microscopic studies have shown that genetically distinct individuals, classified to different VCGs, can also be identified and fused, suggesting that individuals of V. dahliae can effectively exceed this first incompatibility barrier, that was previously described in other ascomycetes.After fusion most of the 'incompatible' anastomoses quickly entered a programmed cell death pathway characterized by nuclear degeneration, cell shrinkage, and compartmentalization of the fused cells through cell wall thickening of the adjacent septae. Unexpectedly, under these conditions a significant portion of the theoretically ‘incompatible’ anastomoses escaped the incompatibility barriers, thus allowing the generation of viable heterokaryotic cells and the possible exchange of genetic material.A newly established complementation test that was based on CAT creation before transfer of the mixture to selective nutrient media, demonstrated that through this process heterokaryotic colonies can arise both in vitro and in planta. In addition, genetic analysis, and DNA content determination through flow cytometry, revealed the existence of diploid cells that were formed from these heterokaryons under appropriate selective conditions. Haploidization process was then monitored with the same approaches, thus confirming the onset and the function of a complete parasexual cycle in V. dahliae, even between strains that were theoretically considered as incompatible. Furthermore, it was found that the parasexual cycle can lead to the production of extensive genetic diversity, as the study of selected parasexual progeny revealed that they showed a variety of morphological, physiological and phytopathological characteristics. Karyotypic and genomic analyses confirmed that the parasexual offspring contained chromosomes from both parents, and in few cases new chromosomes were generated possibly through the function of mitotic recombinations.The search for the genetic determinants of vegetative incompatibility revealed the crucial role of autophagy in the processes of heterokaryosis and heterokaryon incompatibility. Specifically, autophagy has been shown to control nuclear degradation immediately after the formation of CATs, through selective nucleophagy, thus ensuring the existence of a single nucleus per cellular compartment, while it has been shown that it has a protective role against cell death induced by incompatibility. Verticillium dahliae genome contains many homologs of the genes that control incompatibility in other ascomycetes, but their functional analysis has shown that only the vic2 gene (encodes for a Nod-like receptor) participates in heterokaryon incompatibility reaction. These results confirm the hypothesis that fungal species have developed different strategies for the regulation of allorecognition and subsequent induction of incompatibility reaction, and only few mediators of these processes have remained conserved.Finally, functional characterization of genes involved in apoptosis (mca2, endoG), in hyphal protection from physical injury (hex1, major component of Woronin bodies), and in the maintenance of redox homeostasis (noxA, yap1) was performed. Deletion of these genes did not affect incompatibility reaction, but severely affected the morphological and the physiological properties of the fungus, and significantly impaired its pathogenicity and stress response.Overall, the results of this study indicate that in the asexual fungus V. dahliae, the incompatibility barriers are not absolute and under appropriate environmental conditions they can be overcome. This allows the exchange of genetic material and the subsequent creation of genetic diversity through the parasexual cycle, without the need for sexual reproduction, reconsidering the importance of the parasexual cycle in the evolution of this asexual fungal plant pathogen.

Η ετεροκαρυωτική (ή βλαστητική) ασυμβατότητα στους μύκητες είναι ένας από τους πλέον κοινούς τύπους προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και αποτελεί μέρος του μηχανισμού αναγνώρισης ενός έτερου, περιορίζοντας έτσι την εξάπλωση παρασιτικών στοιχείων στους πληθυσμούς. Η ύπαρξη φραγμών ασυμβατότητας φαίνεται πως παρεμποδίζει επίσης την εξέλιξη του παραφυλετικού κύκλου, μια πορεία που ξεκινάει από την αναστόμωση σπορίων ή/και υφών και χαρακτηρίζεται από τον επακόλουθο σχηματισμό βιώσιμων ετεροκαρύων, τη συνύπαρξη γενετικά διακριτών πυρήνων στο ίδιο κυτταρόπλασμα και τελικά την ανταλλαγή γενετικού υλικού μέσω σύντηξης των πυρήνων (καρυογαμία), και τελικά την δημιουργία ενός ασταθούς διπλοειδούς πυρήνα που εισέρχεται στην συνέχεια στην πορεία του απλοειδισμού (τυχαία απώλεια χρωμοσωμάτων). Η ανάπτυξη κατάλληλων δοκιμασιών συμπληρωματικότητας έχει οδηγήσει στην κατάταξη των στελεχών διαφορετικών μυκήτων σε Ομάδες Βλαστητικής Συμβατότητας (Vegetative Compatibility Groups, VCGs), των οποίων τα μέλη μπορούν να αλληλοεπιδράσουν παραφυλετικά μόνο μεταξύ τους. Η ασυμβατότητα έχει μελετηθεί αναλυτικά μόνον σε λίγους μύκητες-πρότυπα και έχει βρεθεί πως ελέγχεται από ένα σύνολο πολυμορφικών γονιδίων het. Ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αναλυτική μελέτη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που επάγεται από την ασυμβατότητα στον αφυλετικό φυτοπαθογόνο ασκομύκητα V. dahliae, καθώς και η συσχέτιση του φαινομένου αυτού με άλλα μονοπάτια κυτταρικού θανάτου και με την πορεία του παραφυλετικού κύκλου.Αρχικά πραγματοποιήθηκε η λειτουργική μελέτη του φαινομένου της αναστόμωσης των κονιδίων (Conidial Anastomosis Tubes, CATs) και διαπιστώθηκε πως στο V. dahliae κάτω από συνθήκες έλλειψης θρεπτικών οι CATs μπορούν να οδηγήσουν στην μεταφορά γενετικού υλικού μεταξύ ‘συμβατών’ ατόμων του μύκητα. Γενετικές αναλύσεις κατέδειξαν πως ο σχηματισμός τους ελέγχεται από τα συντηρημένα σηματοδοτικά μονοπάτια των ΜAP κινασών Fus3 και Slt2, καθώς και από την NADPH οξειδάση Α. Εκτεταμένες κυτταροβιολογικές αναλύσεις απέδειξαν πως γενετικά διακριτά άτομα, που ανήκουν σε διαφορετικές VCGs, μπορούν επίσης να αναγνωρίζονται και να συντήκονται αποτελεσματικά, ξεπερνώντας έτσι το πρώτο επίπεδο ασυμβατότητας που έχει περιγραφεί σε άλλους ασκομύκητες.Η πλειονότητα των ‘ασύμβατων’ αναστομώσεων γρήγορα εισέρχονταν σε ένα μονοπάτι προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που χαρακτηριζόταν από την αποικοδόμηση των πυρήνων, την κατάρρευση των συντηγμένων κυττάρων, και τη διαμερισματοποίηση τους μέσω της έντονης εναπόθεσης χιτίνης στα σέπτα που περιβάλλουν την αντίδραση. Απροσδόκητα, κάτω από αυτές τις συνθήκες ένα σημαντικό ποσοστό των θεωρητικά ασύμβατων αναστομώσεων ξέφευγαν από τους φραγμούς ασυμβατότητας, επιτρέποντας έτσι την δημιουργία βιώσιμων ετεροκαρυωτικών κυττάρων και την πιθανή ανταλλαγή γενετικού υλικού.Η ανάπτυξη μιας νέας δοκιμασίας συμπληρωματικότητας που βασίζεται στην δημιουργία των CATs πριν τη μεταφορά των κυττάρων σε μέσα επιλογής, απέδειξε πως μέσω της διαδικασίας αυτής μπορούν να δημιουργηθούν ετεροκαρυωτικές αποικίες τόσο in vitro όσο και in planta, ενώ κάτω από κατάλληλες επιλεκτικές συνθήκες ανιχνεύθηκε η δημιουργία διπλοειδών κονιδίων, τόσο έμμεσα με γενετικές προσεγγίσεις όσο και άμεσα με ανάλυση μέσω κυτταρομετρία ροής. Παρακολουθήθηκε στη συνέχεια, μέσω αντίστοιχων προσεγγίσεων, και η πορεία του απλοειδισμού επιβεβαιώνοντας έτσι την έναρξη και λειτουργία του πλήρους παραφυλετικού κύκλου στο V. dahliae ακόμη και μεταξύ θεωρητικά ασύμβατων στελεχών. Επιπλέον, διαπιστώθηκε πως η πορεία αυτή μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή εκτεταμένης γενετικής ποικιλομορφίας, καθώς η μελέτη επιλεγμένων παραφυλετικών απογόνων φανέρωσε πως αυτοί εμφάνιζαν πληθώρα μορφολογικών, φυσιολογικών και φυτοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Καρυοτυπικές και γονιδιωματικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν πως οι παραφυλετικοί απόγονοι διέθεταν χρωμοσωμικό υλικό και από τους δυο γονείς, ενώ συχνά μιτωτικοί γενετικοί ανασυνδυασμοί φαίνεται πως οδηγήσαν στη δημιουργία νέων χρωμοσωμάτων.Ακολούθησε στη συνέχεια η αναζήτηση για πιθανούς γενετικούς ρυθμιστές του φαινομένου της ασυμβατότητας και η έρευνα αυτή φανέρωσε τον καθοριστικό ρόλο της αυτοφαγίας στις διαδικασίες της ετεροκαρύωσης και της ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας. Πιο συγκεκριμένα, η αυτοφαγία αποδείχθηκε πως ήλεγχε την αποικοδόμηση των πυρήνων μέσω επιλεκτικής νουκλεοφαγίας, διασφαλίζοντας έτσι την ύπαρξη ενός πυρήνα ανά κυτταρικό διαμέρισμα, αμέσως μετά τη δημιουργία των CATs, ενώ φάνηκε πως προστατεύει τα συντηγμένα κύτταρα από την αντίδραση της ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας. Παρ’ ότι στο γονιδίωμα του V. dahliae υπάρχουν πολλά από τα ομόλογα γονίδια που ελέγχουν την ασυμβατότητα σε άλλους ασκομύκητες, λειτουργική τους ανάλυση απέδειξε πως μόνο το γονίδιο vic2 που κωδικοποιεί για έναν υποδοχέα τύπου Nod επηρεάζει το φαινόμενο και στο V. dahliae, επιβεβαιώνοντας έτσι την υπόθεση πως κάθε οργανισμός έχει αναπτύξει τους δικούς του μηχανισμούς ελέγχου της ασυμβατότητας και λίγα μόνο συστατικά του έιναι συντηρημένα.Τέλος, πραγματοποιήθηκαν λειτουργικές αναλύσεις γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (mca2, endoG), με την προστασία των υφών από τραυματισμό (hex1, κύριο συστατικό των Woronin bodies), καθώς και με την διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας του κυττάρου (noxA, yap1). Η διαγραφή αυτών των γονιδίων απέδειξε πως κανένα από αυτά δε συμμετείχε άμεσα στο φαινόμενο της ασυμβατότητας, αλλά φάνηκε πως επηρέαζαν σημαντικά την μορφολογία, φυσιολογία, φυτοπαθογένεια και την αντίσταση σε κυτταρικό στρες του V. dahliae.Συνολικά, τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής υποδεικνύουν πως στον αφυλετικό μύκητα V. dahliae, οι φραγμοί ασυμβατότητας δεν είναι τόσο απόλυτοι και κάτω από κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες φαίνεται ότι μπορούν να ξεπεραστούν. Αυτό επιτρέπει την ανταλλαγή γενετικού υλικού και τη δημιουργία γενετικής ποικιλομορφίας μέσω του παραφυλετικού κύκλου, χωρίς την ανάγκη φυλετικής αναπαραγωγής, ακόμη και μεταξύ στελεχών από διαφορετικές VCG αναθεωρώντας έτσι τη σημασία που έχει ο παραφυλετικός κύκλος στην εξέλιξη αυτού του αφυλετικού φυτοπαθογόνου μύκητα.