Exploration of fragment-derived modulators of glycoside hydrolases

Abstract

Previous work at York demonstrated that fragment molecules can increase the activity of the glycoside hydrolase, BtGH84. The initial aim of this project was to use fragment-based discovery methods to identify activators of several enzymes used in cellulose degradation where low activity is one of the limiting steps in the industrial process. This was successful for oneenzyme, the fungal glycoside hydrolase, TrBgl2. The characterisation of the mechanism of activation for this enzyme is the main focus of this thesis.A fragment screen of a library of 560 commercially available fragments using a kinetic assay identified a small molecule activator of TrBgl2. An analogue by catalogue approach and detailed kinetic analysis identified compounds that behaved as nonessential activators with up to a 2-fold increase in maximum activation. The compounds did not activate the related bacterial glycoside hydrolase CcBglA demonstrating specificity. Interestingly, an analogue of the initial fragment inhibits both TrBgl2 and CcBglA, apparently through a mixed-model mechanism. Although it was not possible to determine crystal structures of activator binding to 55 kDa TrBgl2, solution NMR experiments demonstrated a specific binding site for the activator. A partial assignment of the NMR spectrum gave the identity of the amino acids at this site, allowing a model for TrBgl2 activation to be built. The activator binds at the entrance of the substrate binding site, stabilizing the enzyme-substrate complex.

Προηγούμενη ερευνητική εργασία στο Πανεπιστήμιο του York έδειξε ότι μικρά μόρια μπορούν να αυξήσουν την ενεργότητα της βακτηριακής γλυκοσιδικής υδρολάσης, BtGH84. Ο αρχικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η χρήση μεθόδων αναζήτησης μικρών μορίων για τον εντοπισμό ενεργοποιητών ενζύμων που χρησιμοποιούνται στην αποικοδόμηση της κυτταρίνης κατά την οποία η χαμηλή ενεργότητα αυτών των ενζύμων αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα κατά τη βιομηχανική διαδικασία. Η μέθοδος αναζήτησης μικρών μορίων ήταν επιτυχής στην γλυκοσιδική υδρολάσης ενός μύκητα, TrBgl2. Ο χαρακτηρισμός του μηχανισμού ενεργοποίησης αυτού του ενζύμου είναι το επίκεντρο της παρούσας εργασίας. Μια βιβλιοθήκη 560 εμπορικά διαθέσιμων μικρών μορίων ελέγχθηκε μέσω μιας δοκιμασίας ενεργότητας η οποία εντόπισε ένα μικρό μόριο-ενεργοποιητή του TrBgl2. Ο έλεγχος χημικών αναλόγων του αρχικού μικρού μορίου-ενεργοποιητή και η λεπτομερής κινητική ανάλυση εντόπισε μόρια που συμπεριφέρονταν ως «nonessential» ενεργοποιητές του TrBgl2 και οι οποίοι αυξάνουν έως δύο φορές την μέγιστη ενεργότητα του ενζύμου. Τα μικρά μόρια-ενεργοποιητές δεν επηρέασαν την ενεργότητα της ομόλογης βακτηριακής γλυκοσιδικής υδρολάσης, CcBglA, αποδεικνύοντας την ειδικότητα αυτών των μορίων. Είναι ενδιαφέρον ότι ένα χημικό ανάλογο του αρχικού μικρού μορίου-ενεργοποιητή αναστέλλει τόσο το TrBgl2 όσο και το CcBglA, μέσω του «mixed-model» μηχανισμού. Αν και δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός της κρυσταλλικής δομής του συμπλέγματος του μικρού μορίου-ενεργοποιητή με το 55 kDa TrBgl2, πειράματα NMR σε διάλυμα έδειξαν μια ειδική θέση δέσμευσής του. Μερική ταυτοποίηση των αμινοξέων του TrBgl2 σε φάσμα NMR προσδιόρισε τα αμινοξέα στη θέση δέσμευσης του μικρού μορίου-ενεργοποιητή, επιτρέποντας τη δημιουργία ενός μοντέλου για την ενεργοποίηση του TrBgl2. Ο ενεργοποιητής προσδένεται στην είσοδο της θέσης δέσμευσης του υποστρώματος, σταθεροποιώντας το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος.