Evaluation of novel methodologies for the analysis of colistimethate sodium against Gram-negative bacteria

Abstract

Colistin is a multicomponent polypeptide antibiotic consisting mainly of colistin A and colistin B, produced by selected strains of Bacillus polymyxa var. colistinus. Colistin was first isolated in 1949, but its use was restricted during 1980s due to neurotoxicity and nephrotoxicity. However, colistin has been re-emerged in clinical practice as a last resort antibiotic to treat life-threatening infections caused by multidrug resistant gram-negative bacteria. Colistin is administrated parenterally as colistimethate sodium (CMS) which is the inactive and less toxic prodrug of colistin that hydrolyzes in vivo in the active drug. CMS is produced by sulfomethylation of the free amine groups of colistin, but the actual structure of CMS still remains unclear, as there is conflict about the degree of sulfomethylation. However, it is stated that CMS is a very complex mixture consisting of partially sulfomethylated components. Colistin, having been discovered several years ago, has not been subjected to the drug development and regulatory approval processes that are applied today. Until now, the quality control procedure of the CMS commercial products is based on microbiological assays.The important point here is that although the above-mentioned products are standardized by microbiological assays in vitro, the exposure to active colistin is different in vivo, emphasizing the need for the development of other methods in order to characterize and consequently standardize the content of CMS prodrugs which will eventually lead to precise control of the drug’s bioavailability.The aim of the study is the development of an analytical methodology based on ultra-high performance liquid chromatography (UPLC) combined with mass spectrometry (MS) on a hybrid quadrupole time-of-flight (QqTOF) instrument that could be used for the quality control of CMS products. The careful optimization of the UPLC and QqTOF parameters was deemed crucial, as CMS is known to be a very complex mixture. Thus, a two stage Design of Experiments (DoE) pipeline was followed, aiming towards the separation of the mixture components. According to the DoE results, a baseline-resolved chromatogram revealing more than 20 compounds was achieved. The separation was performed using a Waters Acquity BEH C8 column employing gradient elution. The mobile phase consisted of aq. ammonium formate 0.005 M (pH 6) (solvent A) and methanol/acetonitrile 79/21 (v/v) (solvent B). A second optimization experiment for the MS signal was employed in order to achieve maximum sensitivity. The singly charged signals were monitored for the validation in the positive ion mode. The calibration curve range was 50 – 110 μg mL-1, corresponding to the 80-120% of the nominal CMS amount in the commercial products. Due to the complexity of the CMS chromatograms and the corresponding spectrum of each chromatographic peak, untargeted and targeted approaches were performed employing the MZmine software. Furthermore, apart from the classical univariate statistical analysis, a partial least squares regression (PLSR) model was also employed, as the variables were more than the observations. The developed methodology has been employed to analyze several batches and inconsistencies have been discovered.Furthermore, a UPLC coupled to ultraviolet (UV) detector methodology was developed for the quantitation of CMS in injectable formulations. Care was taken in order to employ freely-available software in order to be adopted from pharmaceutical companies and even the research community as an easy-to-implement quality control procedure. Design of experiments was performed for the optimization of the chromatographic parameters. The chromatographic separation was achieved using a Waters Acquity BEH C8 column employing gradient elution with a mobile phase consisting of 0.001 M aq. ammonium formate (solvent A) and methanol/acetonitrile 79/21 (v/v) (solvent B). CMS compounds were detected at 214 nm. Twenty-three univariate linear regression models were constructed for the measurement of CMS compounds separately and one PLSR model for the assessment of the total CMS amount in formulations. The method was validated over the range 100 – 220 μg mL-1. The developed methodology was employed to analyze several batches of CMS injectable formulations that were also compared against a reference batch employing principal component analysis (PCA), similarity and distance measures, heatmaps and the structural similarity index.The measurement of CMS levels in patients’ biological fluids is of great importance in order to find the optimal dose regimen reducing the drug toxicity. Until now, CMS assay methods are based on the indirect determination after its hydrolysis to colistin. Herein, the aim is to find the optimal conditions for the complete hydrolysis of CMS to colistin. The reaction was studied at accelerated conditions: 40 °C, 50 °C and 60 °C and the results were evaluated by assessing the Arrhenius equation and computation employing the Tenua software. A validated analytical methodology based on UPLC coupled to a QqTOF instrument was developed for the simultaneous measurement of CMS and colistin. The current methodology resulted in complete hydrolysis in contrast with the previous reported one.Although the use of CMS is increasing rapidly worldwide, the structure of CMS has not been fully determined. Herein, efforts were made in order to shed light to the structure of CMS. Experiments were performed employing mass spectrometry-based approaches. Four types of mass analyzers were used: a) QqTOF, b) LTQ Orbitrap Discovery XL, c) Q-Exactive Orbitrap and d) Οmnitrap. Infusions of CMS were performed under different experimental conditions testing the dilution solvent, the pH and the desolvation temperature. The Kendrick mass effect was also tested. MS/MS experiments were also performed in QqTOF and Omnitrap. Cyclobrach tool was used for the interpretation of MS/MS spectra and the structures of three CMS components were presented.

Η κολιστίνη (πολυμυξίνη Ε) είναι ένα αντιβιοτικό που αποτελείται κυρίως από τις μορφές Α και Β και παράγεται από το βακτήριο Bacillus polymyxa var. colistinus. Απομονώθηκε για πρώτη από το βακτήριο το 1949 και αργότερα χορηγήθηκε ως μεθανοσουλφονική κολιστίνη (colistimethate sodium - CMS) για την αντιμετώπιση των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η χρήση της, όμως, περιορίστηκε τη δεκαετία του ’80 λόγω της νευροτοξικότητας και της νεφροτοξικότητας που προκαλούσε. Λόγω της εμφάνισης πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηριών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η κολιστίνη άρχισε να χρησιμοποιείται ξανά ως αντιβιοτικό τελευταίας εκλογής, όταν όλες οι θεραπείες με άλλα αντιβιοτικά έχουν αποτύχει, καθώς αντιμετωπίζει αποτελεσματικά τις λοιμώξεις που οφείλονται σε αυτά τα βακτήρια. Η κολιστίνη χορηγείται παρεντερικά ως CMS που αποτελεί το ανενεργό και λιγότερο τοξικό προφάρμακο της κολιστίνης, το οποίο υδρολύεται στον οργανισμό (in vivo) δίνοντας την ενεργή μορφή (κολιστίνη). Η CMS παράγεται κατόπιν σουλφομεθυλίωσης των ελεύθερων αμινομάδων που υπάρχουν στο μόριο της κολιστίνης. Ωστόσο, η δομή της παραμένει μέχρι σήμερα ασαφής, καθώς δεν έχει εξακριβωθεί ο βαθμός της σουλφομεθυλίωσης των αμινομάδων. Είναι όμως γενικά αποδεκτό πως η CMS αποτελεί ένα πολύπλοκο μίγμα πολλών μορίων με διαφορετικό βαθμό υποκατάστασης. Η κολιστίνη αν και έχει ανακαλυφθεί εδώ και αρκετά χρόνια, δεν έχει υποβληθεί στις διαδικασίες ανάπτυξης φαρμάκων και έγκρισης που εφαρμόζονται σήμερα. Μέχρι σήμερα, οι έλεγχοι ποιότητας που εφαρμόζονται στα σκευάσματα της CMS βασίζονται σε μικροβιολογικές δοκιμασίες.Έχει παρατηρηθεί όμως πως, αν και τα φαρμακευτικά σκευάσματα της CMS ελέγχονται με μικροβιολογικές δοκιμασίες (in vitro), οδηγούν σε διαφορετικά επίπεδα ενεργής κολιστίνης στον οργανισμό (in vivo), τονίζοντας την ανάγκη για ανάπτυξη άλλων μεθόδων ποιοτικού ελέγχου των σκευασμάτων της CMS, ώστε να ελέγχεται με μεγαλύτερη ακρίβεια η σύσταση των φαρμακευτικών σκευασμάτων και κατ’ επέκταση η βιοδιαθεσιμότητά τους. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου που είναι βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης (ultra-high performance liquid chromatography – UPLC) συζευγμένη με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (high resolution mass spectrometry – HRMS), για την μέτρηση της CMS σε σκευάσματα. Η μέθοδος αυτή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου των φαρμακευτικών σκευασμάτων της CMS. Αρχικά, λόγω της πολυπλοκότητας της CMS, κρίθηκε αναγκαίος ο πειραματικός σχεδιασμός για την βελτιστοποίηση των παραμέτρων τόσο της υγροχρωματογραφίας όσο και της φασματομετρίας μάζας. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει δύο στάδια στοχεύοντας τον διαχωρισμό των συστατικών της CMS. Τελικά, το χρωματογράφημα που προέκυψε αποκάλυψε 20 συστατικά. Ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από A) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,005 Μ, pH=6) και Β) μίγμα μεθανόλης και ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Πειραματικός σχεδιασμός πραγματοποιήθηκε και για τις παραμέτρους της φασματομετρίας μάζας, ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη ευαισθησία. Για την ανάλυση, επιλέχθηκαν τα μονοφορτισμένα ιόντα των μορίων της CMS που προέκυψαν κατόπιν θετικού ιονισμού. Οι καμπύλες αναφοράς είχαν εύρος 50-110 μg/mL, που αντιστοιχεί στο 80-120% της ονομαστικής ποσότητας της CMS στα εμπορικά σκευάσματα. Λόγω της πολυπλοκότητας των χρωματογραφημάτων της CMS, αλλά και του φάσματος κάθε χρωματογραφικής κορυφής, εφαρμόστηκαν τεχνικές στοχευμένης (targeted) και μη στοχευμένης (untargeted) ανάλυσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό MZmine. Εκτός από την κλασική μονοπαραμετρική στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε ακόμα το μοντέλο της παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (partial least squares regression – PLSR), καθώς οι μεταβλητές ήταν περισσότερες από τις παρατηρήσεις. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS και βρέθηκαν διαφορές στη σύστασή τους. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μεθοδολογία βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία συζευγμένη με ανιχνευτή υπεριώδους (ultraviolet – UV) για την μέτρηση της CMS σε ενέσιμα σκευάσματα. Στην μεθοδολογία αυτή χρησιμοποιήθηκαν λογισμικά τα οποία είναι διαθέσιμα δωρεάν προκειμένου με ευκολία θα υιοθετηθεί από τις φαρμακευτικές εταιρείες αλλά και από την ερευνητική κοινότητα γενικότερα, ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου. Για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της χρωματογραφίας χρησιμοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των συστατικών της CMS επιτεύχθηκε με τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,001 Μ) και Β) μίγμα μεθανόλης/ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Τα μόρια της CMS ανιχνεύθηκαν στο μήκος κύματος 214 nm. Κατασκευάστηκαν 23 μονοπαραμετρικά μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης για την μέτρηση του κάθε συστατικού της CMS χωριστά και ένα μοντέλο PLSR για την εκτίμηση της συνολικής ποσότητας της CMS στα ενέσιμα σκευάσματα. Η μέθοδος επικυρώθηκε για το εύρος συγκεντρώσεων 110-220 μg/mL. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS. Οι παρτίδες συγκρίθηκαν ως προς μια παρτίδα αναφοράς με επιπλέον στατιστικές αναλύσεις, όπως ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis – PCA), μέτρα ομοιότητας, χάρτες θερμότητας (heatmaps) και τον δείκτη δομικής ομοιότητας (structural similarity index).Η μέτρηση των επιπέδων της CMS στα βιολογικά υλικά των ασθενών είναι πολύ σημαντική προκειμένου να βρεθεί το κατάλληλο δοσολογικό σχήμα που θα περιορίζει την τοξικότητά της. Μέχρι σήμερα, η μέτρηση της CMS γίνεται με έμμεσο τρόπο, δηλαδή μετά από την όξινη υδρόλυσή της σε κολιστίνη. Στην παρούσα διατριβή, σκοπός είναι να βρεθούν οι συνθήκες που οδηγούν σε πλήρη υδρόλυση της CMS. Η αντίδραση μελετήθηκε σε επιταχυνόμενες συνθήκες: 40°C, 50°C και 60°C και τα αποτελέσματα εκτιμήθηκαν με τη χρήση της εξίσωσης του Arrhenius και το λογισμικό Tenua. Για τη μέτρηση της CMS και της κολιστίνης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος βασισμένη στην υγροχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματόμετρο μάζας με υβριδικό αναλυτή τετραπόλου – χρόνου πτήσης ιόντων (hybrid quadrupole time-of-flight – QqTOF). Με την παρούσα μεθοδολογία επιτεύχθηκε πλήρης υδρόλυση της CMS, σε αντίθεση με τις μεθοδολογίες που αναφέρονται στην βιβλιογραφία που, όπως αποδείχθηκε, οδηγούσαν σε μερική υδρόλυση. Αν και η χορήγηση της CMS αυξάνεται ραγδαία, η δομή της παραμένει ασαφής. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγιναν προσπάθειες αποσαφήνισης της δομής της CMS με τη χρήση της φασμοτομετρίας μάζας. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις αναλυτές μάζας: 1) QqTOF, 2) LTQ Orbitrap Discovery XL, 3) Q-Exactive Orbitrap and 4) Omnitrap. Η έγχυση (infusion) της CMS στον αναλυτή μάζας πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας διαφορετικές συνθήκες ως προς τον διαλύτη αραίωσης, το pH και τη θερμοκρασία αποδιαλύτωσης. Στους αναλυτές μάζας QqTOF και Omnitrap πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα θραυσματοποίησης (MS/MS) και για την ερμηνεία τους χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Cyclobranch. Τελικά, βρέθηκαν οι δομές τριών συστατικών της CMS.