Chemical and biological activity of: Calea sp. from Panama; Centaurea spp. from Algeria; Hypericum spp. from Crete; Euphorbia spp. from Central Greece

Abstract

Plant-derived drugs play an important role in both traditional and modern medicine due to nature’s high potential of yielding therapeutically relevant bioactive compounds, and natural products are emerging as new lead structures for the development of novel drugs for the prevention and treatment of diseases of modern civilization. On the basis of modern bibliographic data, sesquiterpene lactones from Centaurea and Calea, phloroglucinols and essential oils from Hypericum, as well as diterpenoids from Euphorbia were studied, emphasizing on anti-inflammatory and cytotoxic activities. Plants from various families with different phylogenetic relationships and phytochemical profiles have been chosen. Centaurea, Hypericum, and Euphorbia have been referred from Hippocrates (5th century B.C.), and up to now, common uses have been reported for these genera in traditional medicine (including wound-healing, anti-inflammatory, diuretics, antipyretics). When selecting plants from regions with high diversity and endemism (Panama, Algeria, and Greece are biodiversity spots), the probability of finding novel (bioactive or not) substances is higher and demonstrates the potential of different plant species that have never been investigated before. A total of 84 specialized natural products were isolated from endemic plants of cosmopolitan distribution: 26 from Calea jamaicensis, 12 from Centaurea papposa, 24 from Hypericum jovis, and 22 from Euphorbia deflexa. NMR metabolomic strategy was used to target the highly bioactive groups of interest e.g. sesquiterpene lactones, phloroglucinols, and diterpenes in the crude plant extracts and sub-fractions. The isolation procedure included a variety of chromatographic steps using column chromatography in different packing materials (e.g. silica gel, diaion, sephadex), preparative TLC, and HPLC equipped with RI or DAD detector using various columns (eg. RP-C18, RP-Biphenyl, NP). Their chemical structures were elucidated through a combination of HRESIMS, 2D NMR, and X-ray data. 28 sesquiterpene lactones, 14 phloroglucinols, 22 diterpenes, and 20 other compounds were elucidated, among them, 14 sesquiterpene lactones, 2 phloroglucinols, 16 diterpenes, and 3 chromenes are novel natural products and have not been described in the literature before; also the X-ray crystallographic data of 2 diterpenes were reported for the first time. In parallel, more than 120 volatile compounds were identified using GC-MS from the essential oils from Hypericum spp. (H. jovis, H. empetrifolium, H. amblyocalyx, H. triquetrifolium and H. perforatum), belonging mainly to the groups of monoterpene and sesquiterpene hydrocarbons.Several sesquiterpene lactones were evaluated for their cytotoxic effects in vitro reporting IC50 ≤ 10 μM, thus considered to be active and could be potential anti-cancer drugs according to the National Cancer Institute. Carbetolide C afforded IC50 values for HeLa, SK-MEL-28 and HePG2 cells similar to that of parthenolide (2.9, 7.5, 12.6 μΜ and 2.1, 4.9, 10.0 μΜ, respectively), a well-known cytotoxic sesquiterpene lactone used as a positive control. It is noteworthy that the tested SLs revealed no toxicity in the non-cancerous endothelial HMEC-1 cell line, although Michael reactions of the lactone ring usually also involve non-specific toxicity. In the same cell line, sesquiterpene lactones showed strong inhibition of the TNF-α induced ICAM-1 expression, in a dose-dependent manner. Similar results were obtained from phloroglucinols in the ICAM-1 assay, as well as in the ex vivo COX/LOX assay, although only a few studies in the literature demonstrate anti-inflammatory effects from this group of compounds, suggesting the need for further research to explore their anti-inflammatory potential. Regarding diterpenes from Euphorbia plants, although abundant and extremely intriguing in their complicated structure elucidation, most of them presented very weak biological activities. Athough the wound healing activities of Hypericum perforatum infused oil is known, so far, no studies have been conducted on Hypericum essential oils. Besides several non polar ingredients of the essential oil are extracted to the infused oil and contribute to activity. To fulfill this gap, this study describes the investigation of five essential oils in vivo, and their significant wound healing effects gave a new insight into the healing properties of genus Hypericum. The metabolization of natural products is much less studied than their biosynthetic pathways, thus a final goal was the investigation of the in vitro metabolism of the drug-like group of sesquiterpene lactones using human liver microsomes, identified by LC-MS/MS. Sesquiterpene lactones resulted in changeable metabolism due to their structural diversity, though the highly active lactone ring remained the most common metabolic site.As a concluding mark, high cytotoxic, anti-inflammatory, and wound healing effects were reported from natural products derived from Calea jamaicensis, Centaurea papposa, Hypericum jovis, H. empetrifolium, and Euphorbia deflexa. For these taxa, almost no records existed in the literature using modern techniques and investigating the biological activities of their constituents. Nature will still be a source of new drugs in the future, and the results of this study contribute to the natural product-based drug discovery, further supporting the strategic use of natural products as a starting point to investigate novel potential effective agents against a variety of human ailments.

Τα φάρμακα φυσικής προέλευσης παίζουν καίριο ρόλο τόσο στην παραδοσιακή όσο και στην σύγχρονη ιατρική, καθώς η φύση παρέχει μια ανεξάντλητη πηγή βιοδραστικών συστατικών, και ο ρόλος των φυσικών προϊόντων στην εύρεση καινούργιων μορίων-οδηγών για την ανακάλυψη αποτελεσματικών φαρμάκων για μία πληθώρα ασθενειών καθημερινώς ενισχύεται. Με βάση σύγχρονα βιβλιογραφικά δεδομένα, η μελέτη είχε ως στόχο την αναζήτηση και τον εντοπισμό σεσκιτερπενικών λακτονών (από τα ενδημικά είδη Centaurea και Calea), φαινολικών παραγώγων και αιθερίων ελαίων (από ενδημικά είδη Hypericum), καθώς και διτερπενίων (από ενδημική Euphorbia), με έμφαση στην αντιφλεγμονώδη και κυτταροτοξική δράση. Αναφορικά με τα τέσσερα υπό εξέταση είδη, αν και διαφέρουν τόσο στην βοτανική κατάταξη, όσο και στο χημικό προφίλ, εμφανίζουν ομοιότητες, που αφορούν στη βιολογική δράση. Το Κενταύριο, το Υπερικό και η Ευφορβία αναφέρονται απο τον Ιπποκράτη (5ος αιώνας π.Χ.) και παρατηρούμε επίσης ότι έχουν καταγραφεί κοινές χρήσεις και για τα τέσσερα γένη στην παραδοσιακή λαϊκή θεραπευτική μέχρι σήμερα, και συγκεκριμένα αναφέρονται ως επουλωτικά, αντιπυρετικά, αντιφλεγμονώδη, διουρητικά, εμμηναγωγά, για γαστρεντερικές διαταραχές. Είναι σημαντικό ότι τα ενδημικά είδη με στενή εξάπλωση αποτελούν δυνητικά σημαντικές πηγές νέων βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών, δεδομένου ότι τα αντίστοιχα φυτικά είδη από τα ίδια γένη ευρείας όμως εξάπλωσης εμφανίζουν πληθώρα εθνοφαρμακολογικών αναφορών.Συνολικά 84 δευτερογενείς μεταβολίτες απομονώθηκαν από ενδημικά φυτά που φύονται ανά τον κόσμο, και συγκεκριμένα 26 από την Calea jamaicensis, 12 από την Centaurea papposa, 24 από το Hypericum jovis, και 22 από την Euphorbia deflexa. Η ανίχνευση και απομόνωση μεταβολιτών, που ανήκουν στις κατηγορίες των σεσκιτερπενικών λακτονών, φλορογλουκινών και διτερπενίων ήταν κατευθυνόμενη μέσω 1Η NMR (Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού). Οι πορείες απομόνωσης περιελάμβαναν μία πληθώρα χρωματογραφικών τεχνικών, όπως στήλης με διαφορετικά πληρωτικά υλικά (πχ. silica, diaion, sephadex), παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, καθώς και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) με ανιχνευτές RI και DAD και κατάλληλες στήλες (RP-C18, RP-Biphenyl, NP). Οι χημικές δομές αποδώθηκαν με συνδυασμό από δεδομένα NMR, φασματομετρία μάζης (HRESIMS) και κρυσταλλογραφίας (X-ray). Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 28 σεσκιτερπενικές λακτόνες, 14 φλορογλουκινόλες, 22 διτερπένια και 20 άλλα συστατικά, μεταξύ αυτών 14 σεσκιτερπενικές λακτόνες, 2 φλορογλουκινόλες, 16 διτερπένια και 3 χρωμένια αποτελούν νέα φυσικά προϊόντα, που περιγράφονται για πρώτη φορά στη παρούσα εργασία, όπως και τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα από δύο διτερπένια. Παράλληλα, περισσότερα από 120 πτητικά συστατικά ταυτοποιήθηκαν με την τεχνική της αεριοχρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζης (GC-MS) από φυτά του γένους Hypericum (H. jovis, H. empetrifolium, H. amblyocalyx, H. triquetrifolium και H. perforatum), κυρίως μονοτερπενικοί και σεσκιτερπενικοί υδρογονάνθρακες. Οι απομονωμένες σεσκιτερπενικές λακτόνες αξιολογήθηκαν in vitro σε καρκινικές σειρές, παρουσιάζοντας IC50 ≤ 10 μM, τιμές που κατατάσσουν τα μόρια σε δραστικά και πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα με βάση τις οδηγίες από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (National Cancer Institute). Συγκεκριμένα, ο carbetolide C απέδωσε τιμές IC50 για τις καρκινικές σειρές HeLa, SK-MEL-28 και HePG2 παρόμοιες με αυτές του παρθενολιδίου (2.9, 7.5, 12.6 μΜ και 2.1, 4.9, 10.0 μΜ, αντίστοιχα), που αποτελεί ισχυρή αντικαρκινική σεσκιτερπενική λακτόνη και η οποία χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπη ουσία-μάρτυρας (positive control). Είναι σημαντικό πως στο σύνολό τους οι σεσκιτερπενικές λακτόνες δεν παρουσίασαν τοξικότητα στα φυσιολογικά/μη καρκινικά κύτταρα HMEC-1, παρότι οι αντιδράσεις τύπου Michael του λακτονικού δακτυλίου συνήθως περιλαμβάνουν και φαινόμενα μη ειδικής τοξικότητας. Στην κυτταρρική σειρά HMEC-1, οι σεσκιτερπενικές λακτόνες οδήγησαν σε δοσοεξαρτώμενη αντιφλεγμονώδη δράση αναστέλλοντας την επαγόμενη μέσω TNF-α έκφραση του μορίου ICAM-1. Ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση παρουσίασαν επίσης και οι φλορογλουκινόλες τόσο στην in vitro βιοδοκιμασία του ICAM-1, όσο και στην ex vivo βιοδοκιμασία COX/LOX. Πολύ λίγες μελέτες περιγράφουν τις αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες αυτών των ουσιών, καταδεικνύοντας την ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση της δυναμικής τους ως αντιφλεγμονώδεις παράγοντες. Όσον αφορά στα διτερπένια από την Euphorbia, αν και άφθονα με εξαιρετικό ενδιαφέρον στην περίπλοκη απόδοση δομών, τα περισσότερα από αυτά δεν παρουσίασαν αξιόλογες βιολογικές δράσεις. Περαιτέρω, αν και είναι γνωστή η επουλωτική δράση του βαλσαμέλαιου (Oleum Hyperici), δεν είχαν μελετηθεί προηγουμένως οι επουλωτικές ιδιότητες των αιθερίων ελαίων από φυτά του γένους Hypericum, παρότι πτητικά συστατικά συνεκχυλίζονται κατά την παρασκευή του βαλσαμέλαιου. Για να καλυφθεί αυτό το κενό, διερευνήθηκαν in vivo πέντε αιθέρια έλαια και έδειξαν σημαντική επουλωτική δράση, ενισχύοντας τη γνώση για τις θεραπευτικές ιδιότητες του γένους Hypericum. Επιπλέον, ο μεταβολισμός των φυσικών προϊόντων είναι πολύ λιγότερο μελετημένος σε σχέση με τα βιοσυνθετικά τους μονοπάτια, οπότε ένας τελικός στόχος της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του in vitro μεταβολισμού των σεσκιτερπενικών λακτονών χρησιμοποιώντας μικροσώματα ανθρώπινου ήπατος και οι μεταβολίτες ανιχθεύθηκαν με LC-MS/MS. Οι σεσκιτερπενικές λακτόνες οδήγησαν σε ποικίλους μεταβολίτες λόγω της δομικής τους ποικιλομορφίας, αν και ο εξαιρετικά ενεργός δακτύλιος λακτόνης παρέμεινε η πιο κοινή μεταβολική θέση.Συμπερασματικά, αναφέρθηκε υψηλή κυτταροτοξική, αντιφλεγμονώδης και επουλωτική δράση από φυσικά προϊόντα που προέρχονται από τα φυτά που μελετήθηκαν, i.e. Calea jamaicensis, Centaurea papposa, Hypericum jovis, H. empetrifolium και Euphorbia deflexa. Για αυτά τα είδη, υπήρχαν ελάχιστες αναφορές στη βιβλιογραφία. Στη παρούσα διδακτoρική διατριβή μελετήθηκαν αυτά τα είδη χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνικές και διερευνώντας τις βιολογικές επιδράσεις των συστατικών τους. Η φύση θα συνεχίσει να αποτελεί μια πηγή νέων φαρμάκων στο μέλλον και τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης συμβάλλουν στην ανακάλυψη δραστικών ουσιών βασισμένων στα φυσικά προϊόντα, υποστηρίζοντας περαιτέρω τη στρατηγική χρήση φυσικών προϊόντων ως αφετηρία για τη διερεύνηση νέων δομών ως δυνητικών παραγόντων για ποικίλες ανθρώπινες παθήσεις.