Waterborne and foodborne transmission of Cryptosporidium and Giardia in Northern Greece

Abstract

Cryptosporidium and Giardia are important parasitic protozoa, causing gastrointestinal disease in both humans and animals, and both parasites are considered to be zoonotic. The most common route of transmission is through contaminated water and/or food, and they are responsible for many waterborne (sometimes also foodborne) outbreaks of disease worldwide, having an important impact on public health. Contamination of water sources (and consequently of foodstuff) with both protozoa may have many sources, including runoffs from agricultural areas, drainage from manure storage, wastewaters overflows or improper sewage systems. For the current thesis, the Thessaloniki greater area and the Thermaikos Gulf in Northern Greece has been selected as an interesting case scenario to study the dynamics of waterborne transmission of Cryptosporidium and Giardia. The area is characterised by: (i) an urban environment – the city of Thessaloniki (> 1,100,000 inhabitants) is built around Thermaikos Gulf; (ii) an agricultural environment – the area around the city is a dense farming area with numerous cattle and sheep farms; (iii) many surface water sources – there are 4 rivers, i.e. Gallikos, Axios, Loudias and Aliakmonas, that form a large deltaic complex on the northern and western parts of the gulf; (iv) a water production company using water from Aliakmonas river for the production of drinking water for Thessaloniki; (v) 3 wastewater treatment plants that treat human, agricultural and industrial waste, which are either re-used for irrigation or discharged into the gulf; (vi) the most intensive mussel farming of the Mediterranean mussel, Mytilus galloprovincialis, located close to the deltaic complex of the rivers and wastewater discharges, totaling 80-90% of the whole mussel production in Greece. Specifically, the objectives of this Ph.D. thesis were:1.To monitor the presence of Cryptosporidium and Giardia in different water sources in Northern Greece, including surface water, drinking water and treated waste waters.2.To monitor the presence of Cryptosporidium and Giardia in sheep and cattle farms in the vicinity of surface water (rivers), as potential sources of water contamination.3.To determine the Cryptosporidium species/genotypes and Giardia (sub)assemblages, through molecular analyses, in order to evaluate their zoonotic potential and to identify potential sources of water contamination.4.To develop a risk assessment model to identify parameters that can predict the risk of surface water contamination with Cryptosporidium and/or Giardia. 5.To monitor the presence of Cryptosporidium and Giardia in mussels cultured in Thermaikos Gulf. Chapter 1 provides a review of the recently published literature on some important aspects of Cryptosporidium and Giardia. This chapter describes the biology (taxonomy and life cycle) of the parasites, their presence in humans and animals and their zoonotic potential based on molecular data. The transmission routes of the parasites are described, focusing on waterborne and foodborne transmission. An overview of waterborne and foodborne disease outbreaks is also presented. Finally, the most widely used methods for their detection in water and on/in food matrices are briefly described. In Greece, little information is available about water contamination with Cryptosporidium and Giardia and monitoring of drinking water for these parasites is not compulsory. Moreover, although many animal species are infected with both parasites, their role as potential sources of water contamination has not been investigated. The aim of Chapter 2 was to investigate the presence and origin of Cryptosporidium and Giardia in different water sources in Northern Greece and to identify potential contamination sources of human and/or animal origin. Because the detection of (oo)cysts in water matrices is challenging, a second objective was to identify interactions between the presence of these parasites and biotic/abiotic factors, in order to develop risk-assessment models. During a 2-year period, using a longitudinal, repeated sampling approach, 12 locations in 4 rivers, irrigation canals, and a water production company, were monitored for Cryptosporidium and Giardia, using standard methods. Furthermore, 254 faecal samples from animals were collected from 15 cattle and 12 sheep farms located near the water sampling points and screened for both parasites, in order to estimate their potential contribution to water contamination. River-water samples were frequently contaminated with Cryptosporidium (47.1%) and Giardia (66.2%), with higher contamination rates during winter and spring. During a 5-month period, (oo)cysts were detected in drinking water (<1 /litre). Animals on all farms were infected by both parasites, with 16.7% of calves and 17.2% of lambs excreting Cryptosporidium oocysts and 41.3% of calves and 43.1% of lambs excreting Giardia cysts. The most prevalent species identified in both water and animal samples were C. parvum and G. duodenalis assemblage AII. The presence of G. duodenalis assemblage AII in drinking water and C. parvum IIaA15G2R1 in surface water highlights the potential risk of waterborne infection. No correlation was found between (oo)cyst counts and faecal-indicator bacteria. Machine-learning models that can predict contamination intensity with Cryptosporidium (75% accuracy) and Giardia (69% accuracy), combining biological, physicochemical and meteorological factors, were developed. Although these prediction accuracies may be insufficient for public health purposes, they could be useful for augmenting and informing risk-based sampling plans. Marine bivalve shellfish are of public health interest because they can accumulate pollutants in their tissues. As they are usually consumed raw or lightly cooked, they are considered to be a possible source of foodborne infections, including giardiosis and cryptosporidiosis. Although data indicating contamination of shellfish with Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts have been published, comparing results from different studies is difficult, as there is no standardized protocol for the detection and quantification of these parasites in mussels, and different researchers have used different analytical approaches. The aim of Chapter 3 was to identify and characterise the most sensitive protocol for the detection of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in shellfish. In an effort to test the sensitivity and the detection limits of the protocol, every step of the process was investigated, from initial preparation of the mussel matrix through detection of the parasites. Comparative studies were conducted, including several methods previously applied by other researchers, on commercial mussels Mytilus galloprovincialis spiked with a known number of (oo)cysts of both parasites. The preparation of the mussel matrix plays an important role for the sensitivity of the method, thus different techniques were tested, including (ia) removal of the coarse particles from the matrix with sieving, (ib) extraction of the lipids with diethyl ether, and (ic) artificial digestion of the matrix with pepsin digestion solution, and (ii) the use or not of immunomagnetic separation (IMS) for the concentration of the (oo)cysts. Pre-treatment of the mussel homogenate with pepsin digestion solution, followed by IMS, then detection with a direct immunofluorescence assay, achieved the highest sensitivity: 32.1% (SD: 21.1) of Giardia cysts and 61.4% (SD: 26.2) Cryptosporidium oocysts were recovered, with a detection limit of 10 (oo)cysts per g of mussel homogenate. The outcome of the current study was the standardization of a protocol, with defined detection limits, for the detection of those two protozoa in mussels, in order to be used as a reference technique in future studies. Further advantages of this protocol are that it uses the whole mussel as a starting material and does not require difficult handling procedures. The method has potential to be applied in larger surveys and, potentially, to other species of shellfish for the detection of these parasites. In Chapter 4, we investigated the presence of Cryptosporidium and Giardia in Mediterranean mussels, Mytilus galloprovincialis that are cultivated in Thermaikos Gulf, North Greece, which is fed by the four rivers studied in Chapter 2, which were contaminated with both protozoa. Moreover, the occurrence of these protozoa was monitored in treated wastewaters from 3 treatment plants that discharge into the gulf. In order to identify potential sources of contamination and to estimate the risk for human infection, an attempt was made to genotype Giardia and Cryptosporidium in positive samples. Immunofluorescence was used for detection and molecular techniques were used for both detection and genotyping of the parasites. In total, 120 mussel samples, coming from 10 farms, were examined for the presence of both protozoa over the 6-month farming period. None of them were found positive by immunofluorescence microscopy for the presence of parasites. Only in 3 mussel samples, PCR targeting the GP60 gene detected Cryptosporidium spp. DNA, but sequencing was not successful. Thirteen out of 18 monthly samples collected from the 3 wastewater treatment plants, revealed the presence of G. duodenalis cysts belonging to sub-assemblage AII, at relatively low counts (up to 11.2 cysts/L). Cryptosporidium oocysts (up to 0.9 oocysts/L) were also detected in 4 out of 8 samples, although sequencing was not successful at any of the target genes. At the studied location and under the sampling conditions described, mussels tested were not found to be harboring Giardia cysts and the presence of Cryptosporidium was found only in few cases (by PCR detection only). Our results suggest that the likelihood that mussels from these locations act as vehicles of human infection for Giardia and Cryptosporidium seems low. In Chapter 5, data presented in the current thesis are discussed and compared with recently published studies. In general, there is a high abundance of potentially zoonotic Cryptosporidium species and G. duodenalis (sub)assemblages in all water matrices and farm animals tested. A seasonal pattern of contamination has been revealed, with higher contamination rates during rainy months. Animals were considered to be a main source of water contamination through run-off from the surrounding farms, whereas wastewater treatment plants seemed not to contribute to water contamination. Same potentially zoonotic species/genotypes are circulating in the environment and hosts, however lack of multilocus analyses and absence of reported human cases/outbreaks, do not allow us to safely conclude on their impact on public health. Machine learning modelling approaches seem to be a promising tool for the prediction of water contamination by these protozoa and could be used to augment and inform risk-based sampling plans. Finally, Mediterranean mussels farmed under the described contamination pressure of Thermaikos gulf, due to contaminated rivers and wastewaters discharged there, seem to be a low risk food source for human infections with Cryptosporidium spp. and G. duodenalis.

Το Cryptosporidium και η Giardia είναι σημαντικά παρασιτικά πρωτόζωα, τα οποία προκαλούν γαστρεντερίτιδα τόσο στους ανθρώπους όσο και στα ζώα, γι΄αυτό και θεωρούνται ζωοανθρωπονοτικά παράσιτα. Ο πιο κοινός τρόπος μετάδοσης τους είναι μέσω του μολυσμένου νερού και/ή τροφίμων, γεγονός που αποδεικνύεται και από την καταγραφή πολλών επιδημιών υδατογενούς προέλευσης (μερικές φορές και τροφιμογενούς προέλευσης) παγκοσμίως, έχοντας μεγάλο αντίκτυπο στην δημόσια υγεία. Η μόλυνση των υδάτων (και κατ’ επέκταση των τροφίμων) από αυτά τα πρωτόζωα μπορεί να γίνει με πολλούς τρόπους, όπως για παράδειγμα μέσω των απορροών από γεωργικές περιοχές, της αποστράγγισης των εδαφών όπου αποθηκεύεται η κοπριά των ζώων, της υπερχείλησης των λυμάτων ή λόγω ακατάλληλων συστημάτων αποχέτευσης. Για τις ανάγκες της παρούσας διδακτορικής διατριβής, επιλέχθηκε η ευρύτερη περιοχή της Θεσσαλονίκης και ο κόλπος του Θερμαϊκού στη Βόρεια Ελλάδα, με σκοπό τη μελέτη της δυναμικής των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia να μεταδίδονται υδατογενώς. Η περιοχή αυτή επιλέχθηκε καθώς παρουσιαζεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης, καθώς χαρακτηρίζεται από: (i) αστικό περιβάλλον – την πόλη της Θεσσαλονίκης (> 1.100.000 κάτοικοι) η οποία είναι χτισμένη γύρω από τον Θερμαϊκό Κόλπο, (ii) αγροτικό περιβάλλον – η περιοχή έχει ιδαίτερα αυξημένη κτηνοτροφία (υπάρχουν πολλές εκτροφές κυρίως με βοοειδή και μικρά μυρηκαστικά), (iii) πολλά επιφανειακά ύδατα – υπάρχουν 4 μεγάλοι ποταμοί: ο Γαλλικός, ο Αξιός, ο Λουδίας και ο Αλιάκμονας, οι οποίοι εκβάλλουν στον Θερμαϊκό Κόλπο, (iv) την εταιρεία παραγωγής πόσιμου νερού για την ευρύτερη περιοχή, η οποία για το σκοπό αυτό επεξεργάζεται νερό από τον ποταμό Αλιάκμονα, (v) την ύπαρξη 3 μονάδων βιολογικού καθαρισμού οι οποίες επεξεργάζονται ανθρώπινα, βιομηχανικά και γεωργικά απόβλητα, τα οποία είτε επαναχρησιμοποιούνται για άρδευση είτε απορρίπτονται στον Θερμαϊκό Κόλπο, (vi) εντατική καλλιέργεια του Μεσογειακού μυδιού, Mytilus galloprovincialis (αποτελεί το 80-90% της καλλιέργεις μυδιού στην Ελλάδα) στα σημεία των εκβολών των 4 ποτάμων στον κόλπο, αλλά και στα σημεία απόρριψης των επεξεργασμένων λυμάτων.Συγκεκριμένα, οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: 1. Η παρακολούθηση της παρουσίας των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia σε διάφορες πηγές νερού στη Βόρεια Ελλάδα, συμπεριλαμβανομένων των επιφανειακών υδάτων, του πόσιμου νερού και των επεξεργασμένων λυμάτων. 2. Η παρακολούθηση της παρουσίας των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia σε εκμεταλλεύσεις προβάτων και βοοειδών, οι οποίες βρίσκονται κοντά στα επιφανειακά ύδατα (ποτάμια) της περιοχής, ως πιθανές πηγές μόλυνσης των υδάτων. 3. Να προσδιοριστούν τα είδη/γονότυποι/υπότυποι των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia, μέσω μοριακών αναλύσεων, με σκοπό να αξιολογηθεί ο ζωοανθρωπονοτικός τους χαρακτήρας και να εντοπιστούν πιθανές πηγές μόλυνσης των υδάτων. 4. Να αναπτυχθεί ένα μοντέλο εκτίμησης της επικινδυνότητας με σκοπό την αναγνώριση παραμέτρων που μπορούν να προβλέψουν τον κίνδυνο μόλυνσης των επιφανειακών υδάτων με τα παράσιτα Cryptosporidium και/ή Giardia. 5. Η παρακολούθηση της παρουσίας των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia σε μύδια που καλλιεργούνται στον Θερμαϊκό Κόλπο. Στο Κεφάλαιο 1 παρουσιάζεται ανασκόπηση της πρόσφατης δημοσιευμένης βιβλιογραφίας, όπου αναλύονται σημαντικά ζητήματα των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia. Συγκεκριμένα, περιγράφονται η βιολογία (ταξινόμηση και βιολογικός κύκλος) των παρασίτων, η παρουσία τους σε ανθρώπους και ζώα, καθώς και ο ζωοανθρωπονοτικός τους χαρακτήρας βάσει μοριακών δεδομένων. Περιγράφονται οι τρόποι μετάδοσης, εστιάζοντας κυρίως στην υδατογενή και τροφιμογενή μετάδοση. Ακόμη, παρουσιάζεται μία ανασκόπηση των επιδημικών εξάρσεων λόγω μετάδοσης των παρασίτων μέσω του νέρου και των τροφίμων. Τέλος, περιγράφονται εν συντομία οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται ευρέως για την ανίχνευση αυτών των παρασίτων στο νερό και στα τρόφιμα. Στην Ελλάδα υπάρχουν λίγα δεδομένα σχετικά με την μόλυνση των υδάτων με τα παράσιτα Cryptosporidium και Giardia, καθώς ο συστηματικός έλεγχος του πόσιμου νερού για την ύπαρξη αυτών των παρασίτων δεν είναι υποχρεωτικός. Επιπλέον, αν και πολλά είδη ζώων είναι μολυσμένα και από τα δύο παράσιτα, ο πιθανός τους ρόλος ως πηγή μόλυνσης των υδάτων δεν έχει διερευνηθεί. Στόχος του 2ου Κεφαλαίου ήταν η διερεύνηση της παρουσίας και της προέλευσης των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia σε διάφορες πηγές νερού στη Βόρεια Ελλάδα και ο εντοπισμός πιθανών πηγών μόλυνσης ανθρώπινης και/ή ζωικής προέλευσης. Καθώς η ανίχνευση των (ωο)κύστεων αυτών των παρασίτων στο νερό είναι εξαιρετικά δύσκολη, ένας δεύτερος στόχος ήταν να αναγνωριστούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της παρουσίας αυτών των παρασίτων και βιοτικών/αβιοτικών παραγόντων, προκειμένου να αναπτυχθούν μοντέλα εκτίμησης της επικινδυνότητας. Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 2 ετών, πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες δειγματοληψίες σε τακτά χρονικά διαστήματα σε 12 τοποθεσίες από 4 ποτάμια, αρδευτικά κανάλια και την εταιρεία παραγωγής πόσιμου νερού, για την παρακολούθηση της παρουσίας των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia με χρήση κατάλληλων μεθόδων ανίχνευσης. Επιπλέον, συλλέχθηκαν 254 δείγματα κοπράνων ζώων από 15 εκτροφές βοοειδών και 12 εκτροφές προβάτων, που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση με τα σημεία δειγματοληψίας νερού, και εξετάστηκαν για την παρουσία των 2 παρασίτων, ώστε να εκτιμηθεί η πιθανή συμβολή τους στη μόλυνση των υδάτων. Τα δείγματα νερού που συλλέχθηκαν από τα ποτάμια ήταν αρκετά συχνά μολυσμένα με τα παράσιτα Cryptosporidium (47.1%) και Giardia (66.2%), με υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης να καταγράφονται το χειμώνα και την άνοιξη. Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 5 μηνών, ανιχνεύθηκαν (ωο)κύστεις των παρασίτων και στο πόσιμο νερό (<1 /λίτρο). Τα ζώα όλων των εκτροφών ήταν μολυσμένα και με τα 2 παράσιτα, με το 16,7% των μοσχαριών και 17,2% των αρνιών να εκκρίνουν ωοκύστεις Cryptosporidium, ενώ 41,3% των μοσχαριών και 43,1% των αρνιών να εκκρίνουν κύστεις Giardia. Τα πιο συχνά είδη που εντοπίστηκαν τόσο στα δείγματα νερού όσο και στα δείγματα ζώων ήταν το C. parvum και η G. duodenalis υπότυπος AII. Η παρουσία του υπότυπου AII της G. duodenalis και του υπότυπου IIaA15G2R1 του C. parvum τόσο στο πόσιμο νερό όσο και στα επιφανειακά ύδατα τονίζει τον πιθανό κίνδυνο μόλυνσης μέσω του νερού. Δε βρέθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των (ωο)κύστεων των παρασίτων και των βακτηριακών δεικτών μόλυνσης από κόπρανα. Αναπτύχθηκαν στατιστικά μοντέλα μηχανικής μάθησης τα οποία μπορούν να προβλέψουν την ένταση της μόλυνσης με Cryptosporidium (75% ακρίβεια) και Giardia (69% ακρίβεια), συνδυάζοντας βιολογικούς, φυσικοχημικούς και μετεωρολογικούς δείκτες. Τα μοντέλα πρόβλεψης που αναπτύχθηκαν πιθανά να μην θεωρούνται επαρκή για τους σκοπούς της δημόσιας υγείας, λόγω των ποσοστών ακρίβειας, ωστόσο θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για την ενίσχυση και τον ορθό σχεδιασμό στοχευμένων δειγματοληψιών για την πρόληψη του κινδύνου μόλυνσης. Τα θαλάσσια δίθυρα οστρακοειδή παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον για τη δημόσια υγεία, καθώς μπορούν να συσσωρεύουν ρύπους στους ιστούς τους. Θεωρούνται πιθανή πηγή τροφιμογενών λοιμόξεων, συμπεριλαμβανομένων των μολύνσεων που προκαλούνται από τα παράσιτα Cryptosporidium και Giardia, καθώς συνήθως καταναλώνονται ωμά ή μαγειρεμένα πολύ λίγο. Αν και υπάρχουν δημοσιευμένα δεδομένα για τη μόλυνση των οστρακοειδών με κύστεις Giardia και ωοκύστεις Cryptosporidium, είναι πολύ δύσκολη η σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ διαφορετικών μελετών, καθώς δεν υπάρχουν στανταρισμένα πρωτόκολλα για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση αυτών των παρασίτων σε μύδια, με αποτέλεσμα οι ερευνητικές ομάδες να χρησιμοποιούν διαφορετικές μεθόδους. Σκοπός του 3ου Κεφαλαίου ήταν ο ανεύρεση και ο αναλυτικός χαρακτηρισμός του πιο ευαίσθητου πρωτοκόλλου για την ανίχνευση των κύστεων Giardia και των ωοκύστεων Cryptosporidium σε οστρακοειδή. Προκειμένου να ελεγχθεί η ευαισθησία και τα διαγνωστικά όρια του πρωτοκόλλου, κάθε στάδιο της διαδικασίας διερευνήθηκε, από την αρχική προετοιμασία του δείγματος των μυδιών έως και την ανίχνευση των παρασίτων. Πραγματοποιήθηκαν συγκριτικές μελέτες, οι οποίες περιελάμβαναν πολλές μεθόδους που έχουν εφαρμοσθεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες, χρησιμοποιώντας εμπορικά μύδια Mytilus galloprovincialis, τα οποία είχαν προηγουμένως μολυνθεί στο εργαστήριο με γνωστό αριθμό (ωο)κύστεων και των δύο παρασίτων. Η προετοιμασία του δείγματος για την ανίχνευση των παρασίτων στα μύδια παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία της μεθόδου, γι’ αυτό και δοκιμάστηκαν διάφορες τεχνικές: (iα) απομάκρυνση των μεγάλων σωματιδίων από το δείγμα με κοσκίνισμα, (iβ) απομάκρυνση των λιπιδίων με χρήση διαιθυλαιθέρα και (iγ) τεχνητή πέψη του δείγματος με διάλυμα πεψίνης, και στη συνέχεια (ii) χρήση ή όχι του ανοσομαγνητικού διαχωρισμού για τη συγκέντρωση των (ωο)κύστεων των παρασίτων. Το πρωτόκολλο που αποτελείται από την τεχνητή πέψη του ομογενοποιημένου δείγματος μυδιών με διάλυμα πεψίνης, στη συνέχεια τη χρήση του ανοσομαγνητικού διαχωρισμού και τέλος την ανίχνευση των (ωο)κύστεων των παρασίτων με την τεχνική του άμεσου ανοσοφθορισμού, είχε το μεγαλύτερο ποσοστό ευαισθησίας: 32,1% (SD: 21,1) των κύστεων Giardia και 61,4% (SD: 26,2) των ωοκύστεων Cryptosporidium ανιχνεύθηκαν, με όριο ανίχνευσης τις 10 (ωο)κύστεις ανά γραμμάριο ομογενοποιημένου δείγματος μυδιών. Το αποτέλεσμα της παρούσας μελέτης ήταν να στανταριστεί ένα πρωτόκολλο, με καθορισμένα όρια ανίνευσης, για την ανίχνευση αυτών των παρασίτων στα μύδια, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος αναφοράς σε μελλοντικές μελέτες. Επιπλέον πλεονεκτήματα του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου είναι ότι χρησιμοποιεί ολόκληρο το μύδι και δεν απαιτεί δύσκολες διαδικασίες χειρισμού των μυδιών. Τέλος, αυτη η μέθοδος έχει τη δυνατότητα να βρει εφαρμογή σε μεγαλύτερες μελέτες και πιθανά και σε άλλα είδη οστρακοειδών για την ανίχνευση αυτών των παρασίτων. Στο Κεφάλαιο 4, διερευνήσαμε την παρουσία των παρασίτων Cryptosporidium και Giardia σε Μεσογειακά μύδια, Mytilus galloprovincialis, που καλλιεργούνται στο Θερμαϊκό Κόλπο, στη Βόρεια Ελλάδα, όπου εκβάλλουν οι τέσσερις ποταμοί που μελετήθηκαν στο 2ο Κεφάλαιο και βρέθηκαν μολυσμένοι και με τα δύο παράσιτα. Επιπλέον, η ύπαρξη αυτών των πρωτοζώων μελετήθηκε και σε επεξεργασμένα λύματα, από τους 3 βιολογικούς καθαρισμούς λυμάτων, τα οποία απορρέουν μέσα στον κόλπο. Τα θετικά δείγματα για την παρουσία των παρασίτων γονοτυπήθηκαν με σκοπό να εντοπιστούν πιθανές πήγες μόλυνσης και να εκτιμηθεί ο πιθανός κίνδυνος μόλυνσης των ανθρώπων. Για την ανίχνευση των παρασίτων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του ανοσοφθορισμού, ενώ μοριακές τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν τόσο για την ανίχνευση όσο και για τη γονοτύπηση των παρασίτων. Συνολικά 120 δείγματα μυδιών, προερχόμενα από 10 εκτροφές, εξετάστηκαν για την παρουσία των δύο πρωτοζώων, κατά την εξάμηνη περίοδο καλλιέργεας των μυδιών. Με τη χρήση της μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού, κανένα από τα δείγματα δε βρέθηκε θετικό για τα παράσιτα. Μόνο 3 δείγματα ήταν θετικά για την παρουσία DNA του παρασίτου Cryptosporidium spp., όταν έγινε χρήση της μεθόδου PCR με στόχο το γονίδιο GP60, χωρίς όμως η αλληλούχηση να είναι επιτυχής. Δεκατρία από τα 18 μηνιαία δείγματα που συλλέχθηκαν από τους 3 βιολογικούς καθαρισμούς λυμάτων, ήταν θετικά για την παρουσία σχετικά χαμηλού αριθμού κύστεων (έως 11,2 κύστεις/λίτρο) G. duodenalis υπότυπου ΑΙΙ. Σε 4 από τα 8 δείγματα, ανιχνεύθηκαν ωοκύστεις Cryptosporidium (έως 0,9 ωοκύστεις/λίτρο), χωρίς όμως επιτυχία με την αλληλούχηση των γονιδίων στόχων. Στην περιοχή που μελετήθηκε και σύμφωνα με το πρωτόκολλο δειγματοληψιών που περιγράφεται, τα μύδια φαίνεται να μην είναι μολυσμένα με κύστεις Giardia, ενώ ωοκύστεις Cryptosporidium ανιχνεύθηκαν μόνο σε λίγες περιπτώσεις (μόνο με την τεχνική PCR). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, φαίνεται ότι τα μύδια από αυτές τις περιοχές έχουν λίγες πιθανότητες να είναι φορείς ανθρώπινης μόλυνσης από τα παράσιτα Giardia και Cryptosporidium. Στο Κεφάλιο 5, παρουσιάζεται μια γενική συζήτηση των αποτελεσμάτων της διδακτορικής διατριβής, τα οποία συγκρίνονται και με πρόσφατα δημοσιευμένες εργασίες. Γενικά, υπάρχει μεγάλη αφθονία δυνητικά ζωοανθρωπονοτικών ειδών Cryptosporidium και (υπό)τύπων G. duodenalis σε όλα δείγματα νερού και ζώων που εξετάστηκαν. Φαίνεται να επικρατεί ένα εποχιακό μοτίβο μόλυνσης, με υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης κατά τους βροχερούς μήνες. Τα ζώα φαίνεται να είναι η κύρια πηγή μόλυσης του νερού, μέσω των απορροών από τις κτηνοτροφικές μονάδες της περιοχής, ενώ αντίθετα οι μονάδες επεξεργασίας των λυμάτων φαίνεται ότι δεν συμβάλλουν στη μόλυνση του νερού. Τα ίδια δυνητικά ζωοανθρωπονοτικά είδη/γονότυποι κυκλοφορούν στο περιβάλλον και στους ξενιστές, ωστόσο η έλλειψη πολυτοπικών μοριακών αναλύσεων με την ταυτόχρονη έλλειψη ανθρώπινων κρουσμάτων/επιδημικών εξάρσεων δεν μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε με ασφάλεια τις επιπτώσεις τους στη δημόσια υγεία. Η χρήση των μοντέλων μηχανικής μάθησης φαίνεται να αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την πρόβλεψη της μόλυνσης του νερού από αυτά τα πρωτόζωα και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση και το σωστό σχεδιασμό δειγματοληψιών για την πρόληψη του κινδύνου. Τέλος, τα Μεσογειακά μύδια που εκτρέφονται κάτω από το παρασιτικό φορτίο που υπάρχει στο Θερμαϊκό Κόλπο λόγω της μόλυνσης των ποταμών και των επεξεργασμένων λυμάτων που απορρέουν εκεί, φαίνεται να αποτελούν τρόφιμα χαμηλού κινδύνου για μόλυνση των ανθρώπων από Cryptosporidium spp. και G. duodenalis.