Exploring the links between the ZDHHC9 gene and intellectual disability

Abstract

Protein palmitoylation (also known as S-acylation) is a widespread post-translational modification that regulates the trafficking and function of a diversearray of proteins. This modification is catalysed by a family of twenty-three zDHHCenzymes that exhibit both specific and overlapping substrate interactions.Mutations in the gene encoding zDHHC9 cause mild-to-moderate intellectualdisability, seizures, speech and language impairment, hypoplasia of the corpuscallosum and reduced volume of sub-cortical structures. In this thesis, behaviouralphenotyping, magnetic resonance imaging (MRI), isolation of S- acylated proteinsand metabolomics were conducted to investigate the effect of knock- out (KO) ofthe Zdhhc9 gene in mice in a C57BL/6 genetic background. As a first step, end-pointand quantitative Polymerase Chain reaction (PCR) were used to confirm KO ofZdhhc9 expression. Interestingly, although the mutant mice had ablated expressionof mRNA encoding full-length zDHHC9, the mice did express reduced levels of ashorter Zdhhc9 transcript. However, immunoblotting analysis suggested that thisshorter mRNA fragment did not lead to expression of a stable truncated form ofzDHHC9 and further confirmed loss of zDHHC9 expression. Thus, the mouse lineappears to be a true knock-out. The Zdhhc9 KO male mice exhibit a range ofabnormalities compared with their wild-type littermates: altered behaviour in theopen-field test, elevated plus maze and acoustic startle test that is consistent with areduced anxiety level; a reduced hang time in the hanging wire test that suggestsunderlying hypotonia but which may also be linked to reduced anxiety; deficits inthe Morris water maze test of hippocampal-dependent spatial learning and memory;and a 36% reduction in corpus callosum volume revealed by MRI. Surprisingly,palmitoylation of several important pre- and post-synaptic proteins was notdisrupted in either whole brain or hippocampus of Zdhhc9 KO mice, including H-Raswhich has previously been proposed to be a key substrate of zDHHC9. This suggeststhat other unidentified substrates of zDHHC9 are linked to the observed changes. Metabolomic profiling identified the pathways of tryptophan metabolism and ofphenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis as significantly dysregulated inZdhhc9 KO mice. Overall, this study highlights a key role for zDHHC9 in braindevelopment and behaviour and supports the utility of the Zdhhc9 KO mouse line toinvestigate molecular and cellular changes linked to intellectual disability and other deficits in the human population.

Η πρωτεϊνική παλμιτοϋλίωση (επίσης γνωστή ως S-ακυλίωση) είναι μια ευρέως διαδεδομένη μετα-μεταφραστική τροποποίηση που ρυθμίζει την κυκλοφορία και τη λειτουργία μιας ευρείας γκάμας πρωτεϊνών. Αυτή η τροποποίηση καταλύεται από μια οικογένεια είκοσι τριών zDHHC ενζύμων που παρουσιάζουν τόσο ειδικές όσο και επικαλυπτόμενες αλληλεπιδράσεις υποστρώματος. Μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο zDHHC9 προκαλούν ήπια έως μέτρια νοητική υστέρηση, επιληπτικές κρίσεις, γλωσσικές διαταραχές και διαταραχές λόγου, υποπλασία του μεσολοβίου και μειωμένο όγκο υποφλοιωδών δομών. Σε αυτή τη διατριβή, συμπεριφορική φαινοτύπηση, μαγνητική τομογραφία (MRI), απομόνωση S-ακυλιωμένων πρωτεϊνών και μεταβολομική διεξήχθη για τη διερεύνηση της επίδρασης της απενεργοποίησης (ΚΟ) του γονιδίου Zdhhc9 σε ποντίκια με γενετικό υπόβαθρο C57BL/6. Ως πρώτο βήμα, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) τελικού σημείου και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιωθεί η απουσία έκφρασης του Zdhhc9. Είναι ενδιαφέρον ότι αν και τα μεταλλαγμένα ποντίκια είχαν απουσία έκφρασης του mRNA που κωδικοποιεί πλήρους μήκους zDHHC9, τα ποντίκια εξέφρασαν μειωμένα επίπεδα ενός βραχύτερου Zdhhc9 μεταγράφου. Ωστόσο, η ανάλυση ανοσοστύπωσης έδειξε ότι αυτό το βραχύτερο θραύσμα mRNA δεν οδήγησε σε έκφραση μιας σταθερής κολοβωμένης μορφής zDHHC9 και επιβεβαίωσε περαιτέρω την απώλεια έκφρασης του zDHHC9. Έτσι, το συγκεκριμένο μοντέλο ποντικιού φαίνεται να είναι πραγματικό νοκ-άουτ (ΚΟ). Τα αρσενικά ποντίκια Zdhhc9 KO παρουσιάζουν μια σειρά από ανωμαλίες σε σύγκριση με τα άγριου τύπου ποντίκια-συγγενείς τους: διαταραχές στη συμπεριφορά στη Δοκιμή ανοιχτού πεδίου, ανυψωμένου λαβύρινθου και στη δοκιμή ακουστικού ξαφνιάσματος που συνάδει με μειωμένα επίπεδα άγχους, μειωμένο χρόνο ανάρτησης στη δοκιμή ανάρτησης σε σύρμα που υποδηλώνει υποκείμενη υποτονία, αλλά η οποία μπορεί επίσης να συνδέεται με μειωμένο άγχος, ανωμαλία στο τεστ υδάτινου λαβύρινθου Morris για τη χωρική μάθηση και μνήμη που εξαρτάται από τον ιππόκαμπο και 36% μείωση του όγκου του μεσολοβίου που αποκαλύφθηκε με μαγνητική τομογραφία. Παραδόξως, η παλμιτοϋλίωση πολλών σημαντικών προ- και μετασυναπτικών πρωτεϊνών δεν διαταράχθηκε είτε σε ολόκληρο τον εγκέφαλο είτε στον ιππόκαμπο ποντικών Zdhhc9 KO, συμπεριλαμβανομένου του H-Ras που προηγουμένως είχε προταθεί ως βασικό υπόστρωμα του zDHHC9. Αυτό υποδηλώνει ότι άλλα μη αναγνωρισμένα υποστρώματα του zDHHC9 συνδέονται με τις παρατηρούμενες αλλαγές. Το μεταβολομικό προφίλ προσδιόρισε τα μονοπάτια του μεταβολισμού της τρυπτοφάνης και της βιοσύνθεσης φαινυλαλανίνης, τυροσίνης και τρυπτοφάνης ως σημαντικά απορυθμισμένα στα Zdhhc9 KO ποντίκια. Συνολικά, αυτή η μελέτη αναδεικνύει έναν βασικό ρόλο για το zDHHC9 στην ανάπτυξη του εγκεφάλου και τη συμπεριφορά και υποστηρίζει τη χρησιμότητα του μοντέλου ποντικιού Zdhhc9 KO για να διερευνηθούν μοριακές και κυτταρικές αλλαγές που συνδέονται με τη νοητική υστέρηση και άλλες διαταραχές στον ανθρώπινο πληθυσμό.