Alternative activation of macrophages: gene expression profiling in vitro and analysis in atopic dermatitis ex vivo

Abstract

Introduction: Atopic dermatitis (AD) is an immune-mediated inflammation of the skin, often with a significant genetic component. Th2 type cytokines predominate in the acute phase of AD, but there is a shift to Th1 cell involvement and expression of IFN-γ in chronic lesions. Macrophages play an important role in the generation and regulation of immune responses in AD. The cells of the mononuclear phagocyte system are derived from pluripotent haematopoietic stem cells in bone marrow that further differentiate to finally become tissue macrophages. Type 2 activation refers to an alternative activation in the presence of IL-4 and IL-13 that signal through a common receptor chain, IL-4Ra. IL-4 is the main Th2 type cytokine. Aims and general methodologies: This study aims at detecting common elements in the differential gene expression profiles of alternatively activated macrophages and peripheral blood monocytes of patients with atopic dermatitis. For this purpose: (1) the gene expression profiles of alternatively activated macrophages (stimulated by IL-4, TGF-β and IL-4-/TGF-β) were compared to those of control macrophages with the use of microarray analysis, (2) the differential gene expression patterns among these macrophage populations were confirmed via semiquantitative and real-time RT-PCR, and (3) the expression levels of candidate genes confirmed to be differentially expressed were analysed in monocytes from patients with atopic dermatitis as compared to healthy donors. Results: The gene expression profile of IL-4-stimulated monocytes is marked by a prothrombotic tendency, promotion of inflammation-resolving lipoxins, inhibition of inflammatory leukotrienes, upregulation of CCL22 and CCL18, and downregulation of CXCL2 and of certain members of the TNF-α-receptor superfamily. IL-4-(co)stimulated monocytes exhibit a higher expression of Wnt5a (p<0.1 under IL-4 alone and p<0.025 under IL-4/TGF-β), Wht5b (p<0.025), Norrin (p<0.025), and FOXQ1 (p<0.05), in comparison to non-stimulated monocytes, as confirmed by means of real-time RT-PCR. IL-4-(co)stimulated monocytes highly express Fzd8, Fzd7, Ryk, SFRP4, and lack Fzd4, the receptor of Norrin, as confirmed by means of semiquantitative PCR. Primary peripheral blood monocytes of patients with acute atopic dermatitis exhibit in real-time RT-PCR assays a significantly higher expression of FOXQ1 (p<0.05) in comparison to those of healthy non-atopic donors. No gene expression of Wnt5a, Wnt5b and NDP could be detected in blood monocytes of patients with atopic dermatitis. Conclusions: IL-4-stimulated monocytes seem to exhibit a Wnt-gene expression profile which could be compatible with a preferential activation of non-canonical Wnt signalling pathways. Non-canonical Wnt signalling is crucial for cell polarity and oriented cell/tissue movement. FOXQ1, a transcription factor belonging to the forkhead protein family that has only been implicated in hair development, could act in monocytes as an intranuclear mediator of IL-4 effects. In this respect, it will be highly important to identify FOXQ1 target genes in alternatively activated (M2) macrophages. FOXQ1 and its target genes could participate in regulating M2-mediated Th2 type inflammatory reactions such as atopic dermatitis and may allow development of novel therapeutic approaches.

Εισαγωγή: Η ατοπική δερματίτιδα (ΑΔ) είναι μια φλεγμονώδης δερματοπάθεια συχνά με αξιόλογο γονιαδιακό υπόβαθρο. Οι κυτοκίνες τύπου Th2 κυριαρχούν στην οξεία φάση της ΑΔ, αλλά παρατηρείται μεταστροφή σε διεργασίες τύπου Th1 με έκφραση IFN-γ σε χρόνιες βλάβες. Τα μακροφάγα παίζουν σημαντικό ρόλο στη γένεση και ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων στην ΑΔ. Τα κύτταρα της κοκκιώδους-μονοκυτταρικής σειράς προέρχονται από πολυδύναμα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα στο μυελό των οστών και διαφοροποιούνται περαιτέρω σε μακροφάγα κύτταρα των ιστών. Η ενεργοποίηση τύπου 2 αναφέρεται στην εναλλακτική ενεργοποίηση παρουσία IL-4 και IL-13 που σηματοδοτούν μέσω της α αλύσου του υποδοχέα της IL-4 (IL-4Ra). Η IL-4 είναι η κύρια κυτοκίνη τύπου Th2.Σκοπός και βασική μεθοδολογία: Η παρούσα έρευνα στοχεύει στην ανίχνευση κοινών χαρακτηριστικών στη διαφορική γονιαδιακή έκφραση μεταξύ των εναλλακτικά ενεργοποιημένων μακροφάγων και των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος ατοπικών ασθενών. Για το σκοπό αυτό: (1) τα γονιδιακά προφίλ των εναλλακτικά ενεργοποιημένων μακροφάγων (που διεγέρθηκαν με IL-4, TGF-β and IL-4-/TGF-β) συγκρίθηκαν με αυτά μη ενεργοποιημένων μακροφάγων με τη χρήση της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA (microarray), (2) τα μοτίβα διαφορικής γονιδιακής έκφρασης των παραπάνω πληθυσμών μακροφάγων επιβεβαιώθηκαν με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR, ημιποσοτικής και real-time (RT-PCR), και (3) τα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων αναλύθηκαν σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ατοπικών ασθενών συγκριτικά με αυτά υγιών αιμοδοτών. Αποτελέσματα: Το γονιαδιακό προφίλ των μονοκυττάρων που διεγέρθηκαν με IL-4 χαρακτηρίζεται από προθρομβωτική τάση, επαγωγή αντιφλεγμονωδών λιποξινών, αναστολή φλεγμονωδών λευκοτριενών, αύξηση της έκφρασης των CCL22 και CCL18, και μείωση της έκφρασης του CXCL2 και μελών της υπεροικογένειας του υποδοχέα TNF-α. Τα μονοκύτταρα που (συν)διεγέρθηκαν με IL-4 παρουσιάζουν υψηλότερη έκφραση των Wnt5a (p<0.1 υπό διέγερση μόνο με IL-4 και p<0.025 με IL-4/TGF-β), Wht5b (p<0.025), Norrin (p<0.025), και FOXQ1 (p<0.05), συγκριτικά με μη διεγερμένα μονοκύτταρα, όπως επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Τα μονοκύτταρα που (συν)διεγέρθηκαν με IL-4 εκφράζουν σε μεγαλύτερο βαθμό τα Fzd8, Fzd7, Ryk, SFRP4, ενώ δεν εκφράζουν Fzd4, τον υποδοχέα του Norrin, όπως επιβεβαιώθηκε με ημιποσοτική PCR. Τα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ατοπικών ασθενών παρουσιάζουν σε δοκιμασίες RT-PCR σημαντικά υψηλότερη έκφραση του FOXQ1 (p<0.05) συγκριτικά με αυτά υγιών (μη ατοπικών) αιμοδοτών. Έκφραση των Wnt5a, Wnt5b και NDP δεν ανιχνεύθηκε στα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ατοπικών ασθενών.Συμπεράσματα: Τα διεγερμένα με IL-4 μονοκύτταρα εμφανίζουν ως προς την οικογένεια γονιδίων Wnt ένα γονιαδικό προφίλ που υποδεικνύει προτίμηση των μη κανονικών οδών σηματοδότησης Wnt. Οι μη κανονικές οδοί σηματοδότησης Wnt είναι κρίσιμες για την κυτταρική πολικότητα και την προσανατολισμένη κυτταρική/ιστική κινητικότητα. Ο FOXQ1, ένας μεταγραφικός παράγοντας που ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών forkhead και που του έχει αποδοθεί ως τώρα μόνο ένας ρόλος στην ανάπτυξη των τριχών, θα μπορούσε να δρα στα μονοκύτταρα ως ενδοπυρηνικός μεσολαβητής των σημάτων ενεργοποίησης της IL-4. Υπό αυτό το πρίσμα, θα ήταν πολύ σημαντικό να ταυτοποιηθούν γονίδια-στόχοι του FOXQ1 στα εναλλακτικά ενεργοποιημένα (M2) μακροφάγα. Ο FOXQ1 και τα γονίδια-στόχοι του θα μπορούσαν να συμμετέχουν στη ρύθμιση των διαμεσολαβούμενων από M2 ανοσολογικών αποκρίσεων τύπου Th2, όπως αυτές στην ατοπική δερματίτιδα, και πιθανώς θα αποτελούσαν πεδία νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.