The effect of Porhyromonas gingivalis, the keystogen pathogen, on stimulation of human mast cells in periodontal disease

Abstract

Periodontal diseases are a group of common chronic infectious diseases associated with pathogenic microorganisms forming the dental biofilm, affecting the supporting structures of teeth, and leading to their progressive destruction and tooth loss. Periodontitis is the 6th most prevalent disease in the world and the primary cause for tooth loss in adults. Recently, the role of the immune system in the progression of periodontitis was highlighted, indicating that bacterial antigens can trigger an immunopathologic reaction and that the host response is an important factor in determining the extent and severity of the disease. Periodontal tissue breakdown is a result of the complex interplay between the pathogenic bacteria forming the biofilm and the host's immune responses. Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is the species most highly associated with the chronic form of periodontitis and can be detected in up to 85% of the diseased sites. The major virulence factors produced by P. gingivalis are its lipopolysaccharides (LPS). LPS is an outer membrane component recognized by pattern recognition receptors on immune cells and specifically by the toll like receptors (TLR). TLR4 have been identified and characterized as the main pathogen sensor against LPS of most Gram-negative bacteria. During the past decade, the importance of mast cells (MCs) in the defense mechanism against bacterial infections has been increasingly recognized. MCs are multifunctional, immune system secretory cells, well known for their involvement in a wide variety of physiological and pathological processes, including mainly allergic and anaphylactic reactions, through the release of inflammatory mediators. Increasing evidence indicates that MCs are also critical for the pathogenesis of inflammatory diseases such as arthritis, atopic dermatitis, psoriasis, multiple sclerosis, and oral inflammation including periodontal diseases. The increase of MCs numbers, in vivo, in periodontally affected tissues, has drawn attention with respect to the possible participation of MCs in the defense mechanism and destructive events in periodontal disease. Objectives: This in vitro study was designed to a) examine the effects of P. gingivalis LPS on the expression and release of inflammatory mediators from the LAD2 human MC line b) to compare the differential effects of P. gingivalis and E. coli LPS on the expression and release of these mediators from human MCs and c) to assess the functional role of TLR2 and TLR4 in mediator release from MCs stimulated with either LPS. . The mediators selected were the tumor necrosis factor (TNF-α), the vascular endothelial growth factor (VEGF) and the 19monocyte chemoattractant protein (MCP-1) as they have been documented to be significantly implicated in the initiation and progression of periodontal disease,Materials and Methods: LAD2 MCs (kindly supplied by Dr. Kirshenbaum, National Institute of Health, Bethesda, Maryland) derived from a human MC leukemic patient were cultured in StemPro-34 medium supplemented with 100 U/mL of penicillin–streptomycin and 100 ng/mL of Recombinant human stem cell factor (rhSCF). All cells were used during their logarithmic growth period. Substance P (SP) was diluted in Milli-Q water, and a stock solution (10mM) was prepared. Commercially available preparation of P. gingivalis LPS (Invivogen, CA) and E. coli 0111: B4 LPS (Sigma-Aldrich) was used. Bacterial LPS was purified by the supplier to be free from contaminating lipoproteins. SP and LPS were dissolved in sterile distilled water. ELISA kits for TNF-α, VEGF and MCP-1 were obtained from R&D Systems. Purified monoclonal antibodies to human TLR4 and TLR2 (100μg Mab-hTRL4, Mab-hTRL2) were obtained from Invivogen. TNF-α, VEGF, and MCP-1 Taqman probes and Taqman Master Mix were purchased from Applied Biosystems. Beta-hexosaminidase (β-hex) release was assayed as an index of MC degranulation. LAD2 cells (0.5 × 105) were stimulated with LPS (1 μg/ml) and SP (2 μmol/L) for 30 min. SP was used as the positive control and medium alone as the negative control. Results were expressed as the percentage of β-hex released over the total amount present in LAD2 cells. In order to examine the mediator expression on mRNA level, LAD2 cells were stimulated with SP (2 μM), P. gingivalis and E. coli LPS (1 ng/mL) for 6 h. Total mRNA was extracted with a RNeasy Mini kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Relative mRNA abundance was determined from standard curves run within each experiment. An iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories) was used for reverse transcription of each sample. Quantitative real-time PCR was performed with TaqMan gene expression assays (Applied Biosystem) for TNF (Hs99999043_m1), MCP1 (Hs00234140_m1) and VEGF (Hs00900055_m1). Samples were run at 45 cycles by using a real-time PCR system (7300, Applied Biosystems). The mRNA gene expression was normalized to human GAPDH endogenous control (Applied Biosystems). Τo measure de novo–synthesized cytokine/chemokine release, LAD2 cells (1 × 105) were stimulated for 24 h, with a minimum and a maximum concentration of LPS (1 ng/ml and 1 μg/ml respectively). The cells were also stimulated with either SP (2 μM) serving as the positive control or media alone serving as the negative control for 24h. The supernatant fluids were collected by 20centrifugation (5 min, 150 x g), stored at –20° and assayed for TNF-α, VEGF and MCP-1 release using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits according to the protocol suggested by the manufacturer (R&D Systems). To assess the functional role of TLR2 and TLR4, MCs were incubated with either anti-TLR2 or anti-TLR4 polyclonal antibody (2 μg/ml) for 1 h before stimulation with P. gingivalis or E. coli LPS (1 μg/ml). Supernatants fluids were collected and assayed for mediators by Elisa after 24 h. The positive controls were MCs incubated with LPS, but without anti-TLRs, whereas the negative controls were unstimulated MCs. All experiments were performed in triplicates and repeated at least 3 times (n=3). The results are presented as means ± Standard Deviation. Data between different treatment groups were analyzed by using the unpaired 2-tailed Student’s t test (GraphPad Prism 6). Mean values of the parameters were tested by means of the least significant difference test at significance level p < 0.05. Results: Both LPSs used did not induce MCs degranulation in contrast to SP (P<0.05). The stimulation of LAD2 cells with P. gingivalis LPS resulted in a small, but statistically significant increase, in gene expression for all the three mediators (p<0.05). The same results were observed for E. coli LPS regarding the TNF-α and VEGF gene expression (p<0.05). On the contrary, for MCP-1 mRNA expression, even if there was a small increase, it was not statistically significant from the control group (p>0.05). Regarding the two different LPSs used, no statistically significant difference in gene expression was observed. The stimulation of LAD2 cells with SP induced the most potent increase in gene expression for all mediators that was statistically significant from both the Control and the LPSs groups. Regarding the release on a protein level, both LPS concentrations tested (1 ng/ml, 1 μg/ml) led to de novorelease of all the three mediators studied, compared to unstimulated cells (p<0.05). P. gingivalis LPS and E. coli LPS, at the same concentration, triggered approximately, the same amount of de novo release of TNF-α, VEGF and MCP-1, as there was no statistically significant difference (p>0.05). However, there was a tendency of higher levels of mediator release for P. gingivalis LPS in both tested concentrations compared to E. coli LPS. A dose response relationship could not be documented for both LPSs in our study. The release of TNF-α, VEGF and MCP-1 reached the highest concentrations, which were statistically significant in relation to the control and the LPSs Groups (p<0.001) when stimulated with SP (p<0.05). The levels of the three mediators studied, were reduced after pre-treatment with anti-TLR4 and 21anti-TLR2 antibodies in both LPSs Groups. TNF-α levels were significantly reduced in the P. gingivalis Group, after incubation with anti-TLR2 antibody whereas in the E. coli Group, the reduction was more prominent after incubation with the anti-TLR4 antibody. Both anti-TLR4 and anti-TLR2 antibodies significantly reduced VEGF levels after stimulation with either P. gingivalis or E. coli LPS (p<0.05). Interestingly, pre-incubation of LAD2 cells with either antiTLR4 or anti-TLR2 antibodies did not statistically significantly reduce the levels of MCP-1 in either of the LPSs Groups (p>0.05).Conclusions: The increase of MCs in periodontally affected tissues, has called attention with respect to the possible participation of MCs in the defense mechanism and destructive events in periodontal inflammation. Overall, we reported for the first time, that LPS from P. gingivalis selectively, i.e. without degranulation, stimulated MCs to generate and release mediators that have been documented to play an important role in the initiation and progression of periodontal disease, with the same potency as E. coli LPS, TNF-α, VEGF and MCP-1. In addition, we documented that P. gingivalis LPS could function through both TLR2 and TLR4 in MCs. It is undisputable that MCs play a crucial role in the development of inflammation during many pathological processes including allergic reactions as well as during bacterial infection. Therefore, our findings could indicate that MCs might be involved in the emergence of inflammatory processes evolved in response to P. gingivalis infection such as periodontal disease. In addition, the recent identification of a neurogenic component in periodontal disease and the existence of spatial interactions between nerves and MCs in a neural-immune network with the significant effect of SP on MCs, that was documented in our study as well, opens new possibilities for altering the function of these critical immune cells. In the future, it may be possible to develop novel approaches that influence the release of inflammatory molecules and neuropeptides to ameliorate MCs driven inflammation including periodontal disease

Ανασκόπηση: Ως Περιοδοντική νόσος χαρακτηρίζεται η φλεγμονώδης αντίδραση των στηρικτικών περιοδοντικών ιστών, λόγω της συσσώρευσης μικροβιακής πλάκας, που έχει ως αποτέλεσμα την προοδευτική απώλεια πρόσφυσης και απώλεια φατνιακού οστού. Η βακτηριακή συσσώρευση και ο σχηματισμός πλάκας είναι απαραίτητες για την έναρξη της νόσου. Ένα απο τα σημαντικότερα περιοπαθογόνα, που εμπλέκονται στην εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου, είναι ο Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)του οποίου συστατικά του κυτταρικού του τοιχώματος, όπως οι λιπο-πολυσακχαρίτες (LPS), μπορεί να προκαλέσουν ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού μηχανισμού μέσω συγκεκριμένων υποδοχέων στα αμυντικά κυταρρα, τους Toll-like receptors(TLR). Η διασταυρούμενη ομιλία μεταξύ μικροβιακής προσβολής και ανοσο-ανταπόκρισης προκαλείται από κυτοκίνες/χημειοκίνες που εκκρίνονται τοπικά από τα κύτταρα-ξενιστές. Στους σημαντικότερους μεσολαβητές που υπαγορεύουν το ρυθμό και την εξέλιξη της περιοδοντικής καταστροφής μέσω της ενεργοποίησης φλεγμονώδουςς αντίδρασης ανήκει ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α), o αυξητικός αγγειακός ενδοθηλιακός παράγοντας (VEGF) και η χημειοτακτική πρωτείνη των μονοκυττάρων (MCP-1). Πολλές αναφορές, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ετών, έχουν ρίξει φως στo ρόλο συγκεκριμένων κυττάρων που διαμένουν στον συνδετικό ιστό των ούλων και εμφανίζουν σημαντική συνεισφορά στην φλεγμονώδη απόκριση κατά την περιοδοντική νόσο, τα μαστοκύτταρα (MCs). Τα μαστοκύτταρα εμπλέκονται σε πολλές δραστηριότητες, από τον έλεγχο του αγγειακού συστήματος σε βλάβη ή επιδιόρθωση των ιστών, στην αλλεργική φλεγμονή μέχρι και στην άμυνα του ξενιστή. Η σημαντική συμβολή των μεσολαβητών των κυττάρων αυτών, στην διάδοση της φλεγμονώδους απόκρισης καθιστούν τον έλεγχο της δραστικότητας τους,ζωτικής σημασίας για τη διαχείριση πολλών φλεγμονωδών ασθενειών. H αύξηση των μαστοκυττάρων in vivo στις περιοδοντικές βλάβες, ενισχύει την άποψη της συμμετοχής τους, στους πιθανούς μηχανισμούς άμυνας ή/και καταστροφής κατά την διάρκεια της περιοδοντικής φλεγμονής. Ακόμη και εάν πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με τον ποιοτικό και ποσοτικό καθορισμό των μαστοκυττάρων σε υγιείς ή περιοδοντικά προσβεβλημένους ιστούς, ελάχιστες μελέτες έχουν γίνει με σκοπό την μελετή της επίδρασης των περιοπαθογόνων βακτηρίων (όπως Ρ. gingivalis) στην διέγερση και δράση των ανθρωπίνων μαστοκυττάρων.14Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε ως σκοπό να μελετήσει την επίδραση του P. gingivalis LPS, στην διέγερση ανθρωπίνων μαστοκυττάρων, (κυτταρικής σειράς LAD2) και την παραγωγή μεσολαβητών της φλεγμονής. Συγκεκριμένα μελετήθηκε, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε πρωτεινικό επίπεδο, η έκφραση και απελευθέρωση του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF-α), του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και της χημειοτακτικής πρωτεΐνης των μονοκυττάρων (MCP-1) από τα ανθρώπινα διεγειρμένα μαστοκύτταρα. Οι συγκεκριμένοι μεσολαβητές επιλέχθηκαν, καθώς έχουν ενοχοποιηθεί για τον ρόλο τους στην έναρξη και επιδείνωση της περιοδοντικής νόσου. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η ύπαρξη ή όχι, διαφοροποιημένης διέγερσης των κυττάρων και κατ’επέκταση παραγωγή των μεσολαβητών, υπό την επίδραση ιδίων συγκεντρώσεων λιποπολυσακχαριτών προερχόμενοι απο P. gingivalis και E. Coli βακτήρια. Επιπλέον, μελετήκε εάν και μέσω ποιού TLR υποδοχέα, έγινε η διέγερση των ανθρωπίνων μαστοκυττάρων απο το κάθε λιποπολυσακχαρίτη και συγκεκριμένα διερευνήθηκε ο λειτουργικός ρόλος των TLR4 και TLR2. Υλικά και Μέθοδοι: Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ηταν της κυτταρικής σειράς LAD2 (ευγενική χορηγία του Δρ. Kirshenbaum, National Institutes of Health, Bethesda) και προήλθαν από ανθρώπινα μαστοκύτταρα ασθενούς με λευχαιμική μαστοκυττάρωση. Η καλλιέργειά τους έγινε σε μέσο StemPro34 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 100 U/mLπενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης και 100 ng/mL rhSCF (Swedish Orphan Biovitrum AB). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία 37°C σε επωαστήριο με σύστημα ύγρανσης με 5% CO2 . Όλα τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν στο στάδιο λογαριθμικής ανάπτυξής τους. Χρησιμοποιήθηκε εμπορικά διαθέσιμο παρασκεύασμα λιποπολυσακχαρίτη από P. gingivalis (Invivogen) και από E. coli 0111: B4 (Sigma-Aldrich). Τα κιτ μεθόδου sandwichELISA για TNF-α, VEGF και MCP-1 προήλθαν από την R&D Systems. Τα ανθρώπινα μονόκλωνικά αντισώματα TLR4 και TLR2 (100μg Mab-hTLR4, Mab-hTLR2) προήλθαν από την Invivogen και οι ιχνηθέτες Taqman για TNF-α, VEGF, και MCP-1 και το Taqman MasterMix απο την Applied Biosystems. Η δοκιμή έκκρισης β-εξοζαμινιδάσης (β-hex) πραγματοποιήθηκε, χρησιμοποιώντας φθοριομετρική δοκιμή ως δείκτη της απώλειας κοκκίων απο τα μαστοκύτταρα. Τα LAD2 (0,5 × 105) διεγέρθηκαν με LPS η ουσία P (SP) για 30 λεπτά. Η SP (2 μmol/L) χρησιμοποιήθηκε ως ουσία θετικού ελέγχου. Με σκοπό να μετρηθεί η έκκριση de novo των μεσολαβητών υπό εξέταση, τα κύτταρα LAD2 (0.5 × 105) 15διεγέρθηκαν με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις LPS (1 ng/ml και 1 μg/ml) για 24 ώρες. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν επίσης με την ουσία P (SP) (2 μM) η οποία χρησίμευσε ως ουσία θετικού ελέγχου και μή διεγερμένα κύτταρα ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. Τα υπερκείμενα υγρά συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 150 x g), αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία 20° C και υποβλήθηκαν σε δοκιμή για TNF-α, VEGF και MCP-1, χρησιμοποιώντας κιτ ενζυμικής δοκιμής ανοσοπροσρόφησης ELISA. Για την έκφραση σε επίπεδο mRNA, τα LAD2 διεγέρθηκαν είτε με SP (2 μM) ή με LPS από P. gingivalis και E. coli (1 ng/mL) για 6 ώρες. Το συνολικό mRNA εξάχθηκε με κιτ RNeasy Mini. Χρησιμοποιήθηκε κιτ σύνθεσης cDNA iScriptγια την αντίστροφη μεταγραφή κάθε δείγματος. Η ποσοτική qPCR πραγματικού χρόνου ανιχνεύθηκε με δοκιμές γονιδιακής έκφρασης TaqMan για TNF-α (Hs99999043_m1), MCP1 (Hs00234140_m1) και VEGF (Hs00900055_m1). Η γονιδιακή έκφραση mRNAκανονικοποιήθηκε σε ενδογενή έλεγχο του ανθρώπινου γονιδίου GAPDH. Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος των TLR2 και TLR4 στην έκκριση διαμεσολαβητών, τα LAD2 επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα anti-TLR2 ή anti-TLR4 (2 μg/ml) για 1 ώρα πριν από τη διέγερση με LPS από P. gingivalis και E. coli (1 μg/ml). Τα υπερκείμενα υγρά συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμή για διαμεσολαβητές με τη μέθοδο ELISA μετά από 24 ώρες. Οι ουσίες θετικού ελέγχου ήταν κύτταρα επωασμένα με LPS, αλλά χωρίς antiTLR, ενώ οι ουσίες αρνητικού ελέγχου ήταν κύτταρα μή διεγερμένα. Αποτελέσματα: Και τα δύο LPS που χρησιμοποιήθηκαν, δεν προκάλεσαν αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων σε αντίθεση με την ουσία P, η οποία οδήγησε σε σταστιστικά σημαντική αποκκοκίωση των κυττάρων (p < 0.05). Η διέγερση των LAD2 κυττάρων με P. gingivalis LPS είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση, στην γονιδιακή έκφραση και για τους τρεις υπό μελετη μεσολαβητές της φλεγμονής (p <0.05). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και για τον Ε. Coli LPS σχετικά με την έκφραση του γονιδίου TNF-α και VEGF (p < 0.05). Αντιθέτως, η γονιδιακή έκφραση για την MCP-1, ακόμη και αν υπήρχε μικρή αύξηση, δεν ήταν στατιστικά σημαντική από την ομάδα ελέγχου (p > 0.05).Όσον αφορά στα δύο διαφορετικά LPS που χρησιμοποιήθηκαν, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση γονιδίων. Η διέγερση των κυττάρων LAD2 με την ουσία P προκάλεσε την πιο ισχυρή αύξηση της γονιδιακής έκφρασης για όλους τους μεσολαβητές, στατιστικά σημαντική τόσο σε σχέση με την ομάδα ελέγχου όσο και με τις ομάδες LPSs. Όσον αφορά στην απελευθέρωση σε επίπεδο πρωτεΐνης, και οι δύο 16συγκεντρώσεις LPS που ελέγχθηκαν (1 ng / ml και 1 μg / ml) οδήγησαν σε de novoαπελευθέρωση και των τριών μεσολαβητών που μελετήθηκαν, σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (p < 0.05). Τα επίπεδα απελευθέρωσης για TNF-α, VEGF και MCP-1κινήθηκαν στα ίδια επίπεδα για τον P. gingivalis και για E. coli LPS, στην ίδια συγκέντρωση, καθώς δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά (p > 0.05). Ωστόσο, υπήρχε η τάση υψηλότερων επιπέδων απελευθέρωσης για το P. gingivalis LPS και στις δύο υπό εξέταση συγκεντρώσεις σε σύγκριση με το Ε. Coli LPS. H ύπαρξη μιας εξαρτούμενης σχέσης συγκέντρωσης - απόκρισης δεν παρατηρήθηκε και για τα δύο LPS στη μελέτη μας. Η ουσία P οδήγησε σε απελευθέρωση των TNF-α, VEGF και MCP-1 στις υψηλότερες συγκεντρώσεις, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με την ομάδα ελέγχου και τις ομάδες LPS (p < 0.05). Τα επίπεδα των τριών μεσολαβητών που μελετήθηκαν, μειώθηκαν μετά την προ-θεραπεία με αντι-TLR4 και αντι-TLR2 αντισώματα και στις δύο ομάδες LPSs. Τα επίπεδα ΤΝF-α μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα Ρ. Gingivalis, μετά από επώαση με αντίσωμα αντι-TLR2 ενώ στην ομάδα Ε. coli, η μείωση ήταν πιο εμφανής μετά την επώαση με το αντίσωμα αντιΤLR4. Τόσο τα αντι-TLR4 όσο και τα αντι-TLR2 αντισώματα μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα του VEGF μετά από διέγερση είτε με P. gingivalis είτε με Ε. Coli LPS (p < 0.05). Είναι ενδιαφέρον ότι η προ-επώαση κυττάρων LAD2 με αντισώματα αντι-TLR4 ή αντι-TLR2 δεν μείωσε, στατιστικά σημαντικά, τα επίπεδα MCP-1 σε καμία από τις ομάδες LPSs (p > 0. 05).Συμπεράσματα: Η παρούσα ερευνητική προσπάθεια δείχνει για πρώτη φορά ότι ο LPS από το κυριότερο περιοπαθογόνο βακτήριο, P. gingivalis, επιλεκτικά, χωρίς αποκοκκίωση, διεγείρει τα μαστοκύττρα της σειράς LAD2, τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεινικό εππίπεδο για την απελευθέρωση TNF-α, VEGF και MCP-1, μεσολαβητές που έχουν τεκμηριωθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου. Επιπρόσθετα, στην παρούσα μελέτη, δεν παρατηρήθηκε διαφορά του P. gingivalisLPS σε σύγκριση με το E. coli LPS στην ικανότητα διέγερσης και παραγωγής κυτοκινών.Επιπλέον, τεκμηριώσαμε ότι ο P. gingivalis LPS μπορεί να λειτουργεί τόσο μέσω του TLR2 όσο και του TLR4 στην συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε την ουσία P ως ουσία θετικού ελέγχου για όλα τα πειράματα. Η ουσία P είναι ένα νευροπεπτίδιο που εμπλέκεται στη νευρογενή φλεγμονή και είναι ένας σημαντικός νευροδιαμεσολαβητής. Πρόσφατα, το νευρικό σύστημα έχει αναγνωριστεί ως κρίσιμος ρυθμιστής της φλεγμονής και στις περιοδοντικές νόσους. Τα μαστοκύτταρα είναι παρόντα 17στο ανθρώπινο σώμα και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στις αλλεργικές αντιδράσεις όσο και σε φλεγμονώδεις διεργασίες, ιδιαίτερα εκείνες που επιδεινώνονται λόγω άγχους, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η ατοπική δερματίτιδα, η πολλαπλή σκλήρυνση, η ψωρίαση και η περιοδοντική φλεγμονή. Η αναστολή της ενεργοποίησης των μαστοκυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε νέους θεραπευτικούς στόχους για τον έλεγχο της φλεγμονώδους αντίδρασης στους περιοδοντικούς ιστούς.