Μοριακοί μηχανισμοί του VEGF στην αγγειοποίηση και εφαρμογές στην αναγεννητική ιατρική

Abstract

Regenerative Medicine develops cell therapies using the regenerative capacity of human embryonic stem cells (hESC) and their reprogrammed equivalents (hiPSC). It achieves this with the help of tissue engineering by creating optimal microenvironments for the growth and differentiation of stem cells and the creation of implantable tissue structures with the correct spatial organization. The availability of blood vessels is an important requirement for the viability and function of the implantable tissue structure supporting its in vivo development. Tissue regeneration above 100-200μm exceeds the ability to provide nutrients and remove waste by diffusion and requires the creation of a vascular network. Unfortunately, the host's neovascularisation of the implant is a slow process that leads to its low viability. Thus, there is great interest in creating a vascular differentiation protocol for hESC structures to reduce the time required for vascularity and implant survival. Initially we used a protocol for differentiation of hESC in EPC (Endothelial Progenitor Cells) [234], where initially induction is done to mesoderm and in a second stage, which depends exclusively on the action of VEGF, commitment to EPC takes place. In this context, we identified the intradermal subpopulation that is a target of the VEGF and leads to the creation of EPC. To this end, we developed a simple, effective and rapid in vitro approach, where in the absence of feeder cells and low serum content, we caused the differentiation of human pluripotent stem cells-hPSC (hESC and hiPSC) into distinct populations and SMC (contractile and synthetic hPSC-SMC). These populations were extensively characterized by their phenotype (expression of CD44, CD73, CD105, NG2, PDGFRβ markers and contractile proteins) and their functions as hPSC-SMC. They were phenotypically and functionally stable for at least 8 generations and could integrate, stabilize and inhibit vascular network regression during co-culture with EC in vitro. Next, using a methylcellulose-based system, we created 3D spheroids consisting of EC/hPSC-SMC (vascular organoids), which were extensively phenotypically characterized. In addition, vascular organs functioned as starting points for capillary germination in vitro, and their in vivo implantation led to the rapid formation of a complex functional vascular network. Finally, we investigated the angiogenic potential of these vascular organelles during their incorporation into hydrogels consisting of defined components of the extracellular substance (collagen / fibrinogen / fibronectin), which can be used as scaffolds in its field applications.

H Αναγεννητική Ιατρική αναπτύσσει κυτταρικές θεραπείες χρησιμοποιώντας την αναγεννητική ικανότητα των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (hESC) και των επαναπρογραμματισμένων ισοδυνάμων τους (hiPSC). Αυτό το επιτυγχάνει με τη βοήθεια της μηχανικής ιστών δημιουργώντας βέλτιστα μικροπεριβάλλοντα για την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων και τη δημιουργία εμφυτεύσιμων ιστικών κατασκευών με τη σωστή χωροταξική οργάνωση. Η διαθεσιμότητα αιμοφόρων αγγείων αποτελεί μια σημαντική απαίτηση για τη βιωσιμότητα και τη λειτουργία της εμφυτεύσιμης ιστικής κατασκευής υποστηρίζοντας την in vivo ανάπτυξής της. Η αναγέννηση ιστού άνω των 100-200μm υπερβαίνει την ικανότητα παροχής θρεπτικών ουσιών και απομάκρυνσης απορριμμάτων με διάχυση και απαιτεί τη δημιουργία αγγειακού δικτύου. Δυστυχώς, όμως, η αγγείωση του εμφυτεύματος από τον ξενιστή είναι μια αργή διαδικασία που οδηγεί σε χαμηλή βιωσιμότητά του. Έτσι, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη πρωτοκόλλων διαφοροποίσης των hESC σε αγγειακά κύτταρα με στόχο τη δημιουργία αγγειωμένων κατασκευών, ώστε να μειωθεί ο χρόνος που απαιτείται για την αγγείωση του εμφυτεύματος, προάγοντας την επιβίωση του. Αρχικά χρησιμοποιήσαμε ένα πρωτόκολλο διαφοροποίησης των hESC σε EPC (Endothelial Progenitor Cells) [234], όπου στο πρώτο στάδιο γίνεται επαγωγή προς μεσόδερμα και στο δεύτερο, το οποίο εξαρτάται αποκλειστικά από τη δράση του VEGF, γίνεται η δέσμευση προς EPC. Στα πλαίσια αυτά, αναγνωρίσαμε και ταυτοποιήσαμε τον μεσοδερματικό υποπληθυσμό που είναι στόχος του VEGF και οδηγεί στη δημιουργία των EPC. Επίσης, για το σκοπό αυτό, αναπτύξαμε μια απλή, αποτελεσματική και ταχεία in vitro προσέγγιση, όπου απουσία τροφοδοτικών κυττάρων και σε χαμηλή περιεκτικότητα ορού, προκαλέσαμε τη διαφοροποίηση των ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων-hPSC (hESC και hiPSC) σε διακριτούς πληθυσμούς SMC (συσταλτικά και συνθετικά hPSC-SMC). Οι πληθυσμοί αυτοί χαρακτηρίστηκαν εκτενώς ως προς το φαινότυπό τους (έκφραση των δεικτών CD44, CD73, CD105, NG2, PDGFRβ και των συσταλτικών πρωτεϊνών) και τις λειτουργίες τους ως hPSC-SMC. Ήταν φαινοτυπικά και λειτουργικά σταθεροί για τουλάχιστον 8 γεννεές και μπορούσαν να ενσωματωθούν, να σταθεροποιήσουν και να αναστείλλουν την υποστροφή του αγγειακόυ δικτύου, κατά τη συγκαλλιέργια με EC in vitro. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα με βάση τη μεθυλοκυτταρίνη, δημιουργήσαμε 3D σφαιροειδή αποτελούμενα από EC/hPSC-SMC (αγγειακά οργανοειδή), τα οποία χαρακτηρίστηκαν εκτενώς φαινοτυπικά. Επιπλέον, τα αγγειακά οργανοειδή λειτούργησαν ως σημεία εκκίνησης εκβλαστήσεων τριχοειδών in vitro, ενώ η εμφύτευσή τους in vivo οδήγησε στην ταχεία δημιουργία ενός σύνθετου λειτουργικού αγγειακού δικτύου. Τέλος, διερευνήσαμε το αγγειογενετικό δυναμικό αυτών των αγγειακών οργανοειδών κατά την ενσωμάτωσή τους σε υδρογέλες αποτελούμενες από καθορισμένα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (κολλαγόνο / ινωδογόνο / φιμπρονεκτίνη), που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ικριώματα σε εφαρμογές στον τομέα της μηχανικής των ιστών.