Διερεύνηση του φάσματος των πολυμορφισμών των μεταφορέων πουρινών-πυριμιδινών σε συμβιωτικά και παθογόνα βακτήρια

Abstract

The purine transporters are active transport proteins that create inter-membrane input pathways for both important metabolites and their cytotoxic analogues within the cells. Knowledge of the mechanisms that determine the specificity of these proteins in terms of substrates and their potential inhibitors will contribute decisively to the ability to selectively target carriers either for environmental (e.g. controlling the growth of specific groups of microorganisms from the environment) or for therapeutic reasons (e.g. treatment of pathogenic microorganisms with specific medicines), depending on the type of cell or organism we are interested in. This PhD thesis studied the polymorphisms and specific structural-functional differences of the purine-pyrimidine transporters from symbiotic and pathogenic bacteria with the aim of understanding changes in the pattern of identification of different cytotoxic analogues that may be associated with changes in the specificity profile between pathogenic or non- pathogenic bacteria. The first research approach involved a bioinformatic analysis of the differences in predicted amino acid sequences between potential genes of purine-pyrimidine and/or nucleosides transporters (NCS1, NAT/NCS2 and CNT) from phylogenetic groups of related species and strains of bacteria, with emphasis on the group of all different strains of Escherichia/Shigella phylogenetic group, known from genome analyses, and then assessed the impact of these differences on the specificity profile of cytotoxic analogues. The second strategy involved cloning and functional analysis of the respective transporters from pathogenic strains related to Escherichia coli K-12, such as Acinetobacter, Aeromonas, and then studied the specificity profile of the main transporters of the pathogenic strains compared to the profiles of those from non-pathogenic related bacteria. Analysis of the specificity differences of transporters in the NCS1, NAT/NCS2 and/or CNT families from different species and strains of pathogenic and non-pathogenic proteobacteria is expected to contribute to the more effective design of synthetic respective purines according to the specificity profile of the respective target cell proteins.

Οι μεταφορείς πουρινών είναι πρωτεΐνες ενεργού μεταφοράς που δημιουργούν διαμεμβρανικές «διαδρομές» εισόδου τόσο για σημαντικούς μεταβολίτες όσο και για κυτταροτοξικά τους ανάλογα μέσα στα κύτταρα. Η γνώση των μηχανισμών που καθορίζουν την εξειδίκευση των πρωτεϊνών αυτών ως προς τα υποστρώματα και τους δυνητικούς αναστολείς τους, θα συμβάλει αποφασιστικά στην δυνατότητα επιλεκτικής στόχευσης των μεταφορέων είτε για περιβαλλοντικούς (π.χ. έλεγχος της αύξησης συγκεκριμένων ομάδων μικροοργανισμών από το περιβάλλον) είτε για θεραπευτικούς λόγους (π.χ. αντιμετώπιση παθογόνων μικροοργανισμών με ειδικά φάρμακα), ανάλογα με τον τύπο κυττάρου ή οργανισμού που μας ενδιαφέρει. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι πολυμορφισμοί και συγκεκριμένες δομικές-λειτουργικές διαφορές των διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών-πυριμιδινών από συμβιωτικά και παθογόνα βακτήρια με στόχο την κατανόηση αλλαγών στο πρότυπο αναγνώρισης διαφορετικών κυτταροτοξικών αναλόγων που μπορεί να συνδέονται με αλλαγές στο προφίλ εξειδίκευσης μεταξύ συγγενικών παθογόνων ή μη βακτηρίων. Στην πρώτη ερευνητική προσέγγιση πραγματοποιήθηκε πληροφορική ανάλυση των διαφορών στις προβλεπόμενες αλληλουχίες αμινοξέων μεταξύ δυνητικών γονιδίων μεταφορέων πουρινών-πυριμιδινών και/ή νουκλεοσιδίων (οικογένειες NCS1, NAT/NCS2 και CNT) από φυλογενετικές ομάδες συγγενικών ειδών και στελεχών βακτηρίων, με έμφαση στην ομάδα όλων των διαφορετικών στελεχών της φυλογενετικής ομάδας Escherichia/Shigella που είναι γνωστά από τις αναλύσεις γονιδιώματος, και, στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η επίπτωση των διαφορών αυτών στο προφίλ αναγνώρισης τοξικών αναλόγων μέσω συνδυαστικής μεταλλαξιγένεσης. Στη δεύτερη στρατηγική πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και λειτουργική ανάλυση των αντίστοιχων ομολόγων μεταφορέων από παθογόνα στελέχη συγγενικά προς την Escherichia coli K-12, όπως των γενών Acinetobacter και Aeromonas και, στη συνέχεια, μελετήθηκε το προφίλ εξειδίκευσης των κυριότερων μεταφορέων των παθογόνων στελεχών σε σύγκριση προς τα προφίλ των ομόλογων μεταφορέων από μη παθογόνα συγγενικά βακτήρια. Η ανάλυση των διαφορών εξειδίκευσης των μεταφορέων των οικογενειών NCS1, NAT/NCS2 και/ή CNT από τα διαφορετικά είδη και στελέχη παθογόνων και μη πρωτεοβακτηρίων αναμένεται να συμβάλει στον αποτελεσματικότερο σχεδιασμό συνθετικών αναλόγων πουρινών ανάλογα με το προφίλ εξειδίκευσης των αντίστοιχων πρωτεϊνών των κυττάρων-στόχων.