The role of polycystin 1 and 2 in cranial suture fusion

Abstract

Craniosynostosis refers to the premature fusion of one or more cranial sutures leading to skull shape deformities and brain growth restriction. It is the second most clinically significant craniofacial disorder and, to date, management of this disease is limited to complicated surgical procedures. Among the many factors that contribute to abnormal suture fusion, mechanical forces seem to play a major role. Nevertheless, the underlying mechanobiology-related mechanisms of craniosynostosis still remain unknown. Understanding how aberrant mechanosensation and mechanotransduction pathways drive premature suture fusion will offer important insights into the pathophysiology of craniosynostosis and result in the development of new therapies, which can be used to intervene at an early stage, preventing premature suture fusion. The present study aimed to investigate the implication of PC1 in the pathogenesis of non-syndromic craniosynostosis and elucidate the underlying molecular mechanisms. This thesis provides evidence for the first time on the implication of a key mechanosensory protein, polycystin-1 (PC1) in the pathogenesis of craniosynostosis. Protein expression of PC1 and PC2 was detected in bone fragments and primary cranial suture cells derived from craniosynostosis patients with trigonocephaly and dolichocephaly, two common non-syndromic subtypes. The cleaved cytoplasmic tail of PC1 (PC1-CT) that mediates mechanotransduction was detected in cranial suture cells indicating putative PC1 activation and possible interaction with intracellular pathways and transcription factors to regulate cell function. By using cranial suture cells isolated from patients with trigonocephaly and dolichocephaly, the two common types of craniosynostosis, we have performed mechanistic studies. Τo investigate the functional role of PC1 in cranial suture cells, we blocked the PC1 extracellular mechanosensing domain using a specific IgPKD1 antibody. PC1 inhibition induced elevation of p-AKT (Ser473) and PTEN levels. This was followed by an activation of mTOR signalling pathway which resulted in increased proliferation and migration of cranial suture cells. At the same time, 19 inhibition of PC1 increased RUNX2, a transcription factor associated with osteoblast differentiation, in cranial suture cells as well as osteocalcin an osteogenesis marker demonstrating that PC1 regulates the runt-related transcription factor 2 (RUNX2) activation and osteocalcin gene expression via activation of extracellular signalregulated kinase (ERK) signaling. Altogether, our study reveals a novel mechanotransduction signaling axis, PC1-ERK- RUNX2, which affects osteoblastic differentiation in cranial suture cells from trigonocephaly and dolichocephaly patients. All the above, will contribute to the identification of new therapeutic targets or prognostic markers in non-syndromic craniosynostosis as well as identifying the key role of PC1 in a new therapeutic scheme against craniosynostosis at a diagnosis level, advancing our knowledge of craniosynostosis biology.

Η κρανιοσυνοστέωση αναφέρεται στην πρόωρη σύγκλιση μίας ή περισσοτέρων κρανιακών ραφών που οδηγούν σε παραμορφώσεις του κρανίου και στον περιορισμό της ανάπτυξης του εγκεφάλου. Είναι η δεύτερη συχνότερη, κλινικά σημαντική κρανιοπροσωπική διαταραχή και, μέχρι σήμερα, η αντιμετώπιση αυτής της ασθένειας περιορίζεται σε πολύπλοκες χειρουργικές επεμβάσεις. Μεταξύ διαφόρων παραγόντων που συμβάλλουν στην ανώμαλη σύγκλιση ραφών, οι μηχανικές δυνάμεις φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο. Ωστόσο, οι βασικοί μηχανισμοί της κρανιοσυνοστέωσης που σχετίζονται με τη μηχανοβιολογία παραμένουν άγνωστοι. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η παρεκκλίνουσα μηχανοευαισθησία και η μηχανική μεταγωγή προωθούν την πρόωρη σύγκλιση ραφών θα προσφέρουν σημαντικές πληροφορίες για την παθοφυσιολογία της κρανιοσυνοστέωσης και θα οδηγήσουν στην ανάπτυξη νέων θεραπειών, οι οποίες θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παρέμβαση σε πρώιμο στάδιο και πρόλη η της πρόωρης σύγκλισης. Στην παρούσα έρευνα, παρέχουμε στοιχεία για πρώτη φορά σχετικά με το ρόλο της πολυκυστίνης-1 (PC1), μιας βασικής πρωτεΐνης στην κυτταρική μηχανική ευαισθησία, στην κρανιοσυνοστέωση, χρησιμοποιώντας κύτταρα που έχουν απομονωθεί από ασθενείς με τριγωνοκεφαλία και δολιχοκεφαλία, δύο συνηθισμένους τύπους κρανιοσυνοστέωσης. Η πρωτεϊνική έκφραση της PC1 πραγματοποιήθηκε μέσω της ανίχνευσης του καρβοξυτελικού της άκρου, της ενεργού μορφής της πρωτεΐνης, σε θραύσματα οστών και πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων κρανιακών ραφών, προερχόμενα από ασθενείς με τριγωνοκεφαλία ή δολιχοκεφαλία, δύο κοινούς μη-συνδρομικούς υποτύπους κρανιοσυνοστέωσης. Η ενεργοποίηση της PC1 υποδεικνύει πιθανή αλληλεπίδραση με ενδοκυτταρικές οδούς και παράγοντες μεταγραφής για τη ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας. Με βάση το μοντέλο κυττάρων που έχουν απομονωθεί από ανθρώπινους ιστούς συνοστεομένων ραφών, πρώτα διερευνήσαμε τον λειτουργικό ρόλο της PC1, αποκλείοντας το PC1 εξωκυττάριο άκρο της με ένα ειδικό αντίσωμα. Ο αποκλεισμός του εξωκυττάριου άκρου της PC1 προκάλεσε αύξηση των επιπέδων p-ΑΚΤ (Ser473) και ΡΤΕΝ, και ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού mTOR. Παρατηρήθηκε 17 αυξημένος πολλαπλασιασμός και μετανάστευση των κυττάρων πρωτογενών καλλιεργειών κρανιακών ραφών. Ταυτόχρονα, η αναστολή της PC1 αύξησε τα επίπεδα του RUNX2, ενός παράγοντα μεταγραφής που σχετίζεται με τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών καθώς και της οστεοκαλσίνης, ενός δείκτη οστεογένεσης, αποδεικνύοντας ότι η PC1 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής 2 (RUNX2) και την έκφραση του γονιδίου της οστεοκαλσίνης μέσω της εξωκυττάριας σήματο-ρυθμιζόμενης κινάσης ERK. Συνολικά, η μελέτη μας αποκαλύπτει έναν νέο άξονα μηχανικής μεταγωγής σήματος, τον PC1-ERK-RUNX2, ο οποίος επηρεάζει την οστεοβλαστική διαφοροποίηση των κυττάρων των κρανιακών ραφών από ασθενείς με τριγωνοκεφαλία και δολιχοκεφαλία. Τα παραπάνω ευρήματα, θα συμβάλλουν στον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων ή προγνωστικών δεικτών σχετικά με τη μησυνδρομική κρανιοσυνοστέωση, καθώς και στον εντοπισμό του βασικού ρόλου του PC1 σε ένα νέο θεραπευτικό σχήμα κατά της κρανιοσυνοστέωσης σε επίπεδο διάγνωσης.