Ανάπτυξη mRNA μορίων στη θεραπευτική προσέγγιση μεταβολικών/μονογονιδιακών νοσημάτων με την αξιοποίηση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγτής (PTDs/CPPs)

Abstract

The in vitro transcribed (IVT)-mRNA resembles the natural mRNA and its successful intracellular delivery allows the transient expression of the corresponding exogenous protein by the cells' own translational machinery. The strongest advantage of IVT-mRNA technology is that mRNA molecules do not interfere with the host genome. Its successful application relies on the development of safe and efficient delivery, which remains challenging. In this doctoral dissertation, an innovative methodology for combining the technology of Protein Transduction Domains (PTDs) with IVT-mRNA was developed as a delivery platform, forming the PTD-IVT-mRNA. PTD technology employs short peptides, able to transduce almost all cellular membranes, carrying intracellularly a variety of «cargoes» from micro-molecules to macromolecules. The produced, capped and poly-(A) tailed, IVT- mRNAs can be combined with a selected PTD, thus offering a delivery platform for any possible therapeutic IVT-mRNA of interest and as an alternative approach to Protein Replacement Therapy (PRT). To evaluate the efficacy of the transduction capacity and translation of each protein, the PTD- IVT-mRNA platform was selected to be studied in two disease models, β-thalassemia and a primary mitochondrial disorder, the fatal infantile cardioencephalomyopathy and cytochrome c oxidase (COX) deficiency, due to mutations in the SCO2 gene. Initially, several plasmid vectors were designed and cloned, to produce the templates of the in vitro transcription, which carried the coding sequence of either the Green Fluorescence Protein (GFP) gene, the β-globin gene or the SCO2. Upstream and downstream of the respective coding sequence, the 5′-UTR (murine β-globin) and 3′-UTR (human β- globin) were coned, respectively, for greater stability of the produced IVT-mRNA produced. The IVT- mRNA was then conjugated to the selected PTD and PTD-IVT-mRNA analysis by NMR spectroscopy confirmed the successful conjugation. In addition, during the stability experiments, the PTD-IVT- mRNA showed significantly increased resistance and relatively no degradation, after incubation, under adverse conditions, in the presence of harmful RNases, compared to the naked IVT-mRNA. In the preliminary experiments, for the initial evaluation of the innovative PTD-IVT-mRNA platform, it was applied in human K-562 cell line model, using the IVT-mRNA of GFP, as a marker of IVT-mRNA transduction and protein expression. Then, transduction experiments with the PTD-IVT-mRNA followed, of both β-globin and SCO2, in K-562 cells, and the intracellular IVT-mRNA transduction and kinetic expression of each protein were studied, with encouraging results. Subsequently, the evaluation of the PTD-IVT-mRNA platform was performed on bone marrow cells, derived from three β-thalassemia patients, as well as in primary fibroblasts, derived from a patient with SCO2/COX deficiency. Interestingly, PTD-IVT-mRNA also exhibits encouraging rates of intracellular IVT- mRNA transduction and high expression efficacy. Moreover, complementation of the phenotype was also demonstrated by increasing COX function, in the case of intracellular transduction of PTD-IVT- mRNA of SCO2, into fibroblasts, from a patient with SCO2/COX deficiency. The results showed a high potential for intracellular transduction of PTD-IVT-mRNA, as it addresses problems of stability, transduction, and translation of IVT-mRNAs, suggesting that the PTD-IVT-mRNA is a potential candidate for Protein Replacement Therapy, both for monogenic and mitochondrial-metabolic disorders.

Το in vitro μεταγραφόμενο (in vitro transcribed, IVT)-mRNA μοιάζει με το φυσικό mRNA και η επιτυχής ενδοκυττάρια μεταφορά του, επιτρέπει την παροδική έκφραση της αντίστοιχης εξωγενούς πρωτεΐνης, από τον ίδιο το μεταφραστικό μηχανισμό των κυττάρων. Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίας IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η επιτυχημένη εφαρμογή του IVT-mRNA βασίζεται στην ανάπτυξη ασφαλούς και αποτελεσματικής μεταφοράς, η οποία παραμένει ακόμα μια πρόκληση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή σχεδιάστηκε ως πλατφόρμα μεταφοράς, μια καινοτόμος μεθοδολογία για το συνδυασμό της τεχνολογίας των Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction Domains, PTDs) με το IVT-mRNA, σχηματίζοντας το PTD-IVT-mRNA. Η τεχνολογία PTD χρησιμοποιεί μικρά σε μέγεθος πεπτίδια, ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυτταρικά μια ποικιλία «φορτίων». Το παραγόμενο, με καλύπτρα και πολυ-(Α) ουρά IVT-mRNA μπορεί να συνδυαστεί με ένα επιλεγμένο PTD, προσφέροντας έτσι μια πλατφόρμα μεταφοράς για οποιοδήποτε πιθανό θεραπευτικό IVT-mRNA του ενδιαφέροντος και ως μια εναλλακτική προσέγγιση της Θεραπείας Πρωτεϊνικής. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ικανότητας μεταγωγής και της μετάφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, το PTD-IVT-mRNA επιλέχθηκε να μελετηθεί σε δύο μοντέλα ασθενειών, στη β-θαλασσαιμία και σε μια πρωτογενή μιτοχονδριακή διαταραχή, τη θανάσιμη βρεφική καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια και ανεπάρκεια της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX), λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο SCO2. Αρχικά, σχεδιάστηκαν και κλωνοποιήθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς, οι οποίοι αποτέλεσαν τα εκμαγεία για την in vitro μεταγραφή και οι οποίοι έφεραν την κωδική αλληλουχία, είτε του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), της β-σφαιρίνης, είτε του γονιδίου SCO2. Ανοδικά και καθοδικά της εκάστοτε κωδικής αλληλουχίας κλωνοποιήθκαν οι αμετάφραστες περιοχές (UTRs): το 5′-UTR και το 3′-UTR, της ποντικίσιας και ανθρώπινης β- σφαιρίνης, αντίστοιχα, για σκοπούς μεγαλύτερης σταθερότητας του IVT-mRNA. Ακολούθως, το IVT-mRNA συζεύχθηκε με το επιλεγμένο PTD και η ανάλυση του PTD-IVT-mRNA, με φασματοσκοπία NMR, επιβεβαίωσε την επιτυχή σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA. Επιπλέον, στα πειράματα σταθερότητας, το PTD-IVT-mRNA έδειξε σημαντικά αυξημένη αντοχή και σχετικά καμία αποδόμηση, μετά από επώαση σε αντίξοες συνθήκες, με την παρουσία επιβλαβών RNασών, σε σχέση με το γυμνό IVT-mRNA. Στα πλαίσια προκαταρκτικών πειραμάτων, για την αξιολόγηση της καινοτόμου PTD-IVT-mRNA πλατφόρμας, έγινε εφαρμογή στο μοντέλο ανθρώπινων Κ-562 κυττάρων, με τη χρήση του IVT-mRNA της GFP, ως δείκτη της μεταγωγής και της πρωτεϊνικής έκφρασης. Ακολούθησαν, τα πειράματα επώασης του PTD-IVT-mRNA, τόσο της β-σφαιρίνης, όσο και του SCO2, στα Κ-562 κύτταρα και μελετήθηκε η ενδοκυττάρια μεταγωγή και η κινητική έκφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Ακολούθως, η αξιολόγηση του PTD-IVT- mRNA διεξήχθηκε σε κύτταρα μυελού των οστών από τρεις β-θαλασσαιμικούς ασθενείς αλλά και σε πρωτογενείς ινοβλάστες, προερχόμενους από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Είναι ενδιαφέρον ότι το PTD-IVT-mRNA εμφανίζει επίσης ενθαρρυντικά ποσοστά ενδοκυττάριας μεταγωγής και υψηλή αποτελεσματικότητα έκφρασης. Aκόμα, αποδείχθηκε η αναστροφή του φαινοτύπου, μέσω της αύξησης της λειτουργικότητας της COX, στην περίπτωση του PTD-IVT-mRNA του SCO2, στους ινοβλάστες, από ασθενή με ανεπάρκεια SCO2/COX. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια υψηλή δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής του PTD-IVT-mRNA, αφού αντιμετωπίζει προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης των IVT-mRNA, υποδηλώνοντας ότι το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια Θεραπείας Πρωτεϊνικής Αντικατάστασης, τόσο σε μονογονιδιακές, αλλά και σε μιτοχονδριακές-μεταβολικές διαταραχές.