Geobiological mechanisms that determine microbial community structure and biogeochemical metal cycling in submarine hydrothermal vent fields in Santorini and Kolumbo, hellenic volcanic arc

Abstract

Submarine hydrothermal vent habitats are characterized by the venting of hot chemically-altered, largely reductive, hydrothermal fluids, which are created by the subseafloor interaction of entrained seawater with igneous rock. The discharge of the hydrothermal fluids on the ocean floor creates thermal and chemical gradients, and it is thought today that this is where some of the earliest life on Earth may have originated. The interaction of hydrothermal fluids with cold, oxygenated seawater causes the precipitation of hydrothermal deposits, i.e. polymetallic seafloor massive sulfides (SMS) and seafloor metalliferous deposits enriched in Fe oxides, hydroxides, and oxyhydroxides (FeOx deposits). The former occurs in the form of chimneys and mounds, and the latter as microbial mats, mounds and chimney structures. Chemolithotrophic microorganism that colonize the hydrothermal deposits, chimneys and mats use the available chemical substrates. and build microbial communities with high taxonomic and functional diversity. However, our understanding of how the presence or absence of active venting affects the microbial communities and how these communities participate in the formation of sulfide or oxyhydroxide minerals is limited. The aim of this dissertation is the understanding of the diversity and structure of microbial communities, the study of microbial metabolic potential and the interplay between microbial communities, geochemistry and mineralogy. With this aim, during this dissertation, samples were collected from the hydrothermal vent fields of the Kolumbo submarine volcano, and Santorini caldera to be used in four interconnected studies. In the first study, dual-index Illumina sequencing of the 16S rRNA gene (amplicon sequencing) was performed on the total environmental DNA of microbial communities on active and inactive hydrothermal sulfide chimneys from the Kolumbo seafloor hydrothermal vent field. A total of 15,701 OTUs (operational taxonomic units) were assigned to 56 bacterial and 3 archaeal phyla, subdivided into, 133 bacterial and 16 archaeal classes. Thermophilic OTUs related to members of Epsilonproteobacteria, Aquificae and Deltaproteobacteria dominated active chimney communities. OTUs affiliated to the archaeon, Nitrosopumilus sp., and members of the Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Planctomycetes and Bacteroidetes, predominated inactive chimney communities. These lineages are closely related to phylotypes typically involved in iron, sulfur, nitrogen, hydrogen and methane cycling. Overall, the inactive sulfide chimneys presented highly diverse and uniform microbial communities, in contrast to the active chimney communities, dominated mainly by chemolithoautotrophic and thermophilic lineages.In the second study, seawater samples were collected from 8 different depths of the deep (430-495 m) and surface (5-90 m) layers of the water column above the active area of the Kolumbo volcano. The water samples were used to calculate their nutrient content and for the culturing and isolation of mesophilic bacteria of geomicrobiological interest and with potential biotechnological use. A total of 232 bacterial strains were isolated that belong to the Gram-positive Bacilli and the Gram-negative Alpha-, Beta- and Gammaproteobacteria. Pseudomonas was the most abundant genus in all the isolated strains from the Kolumbo waters. The isolated strains demonstrated a low phylogenetic and taxonomic diversity, in contrast with the high microbial diversity observed in culture-independent studies of hydrothermal chimneys and sediments. The low phylogenetic diversity of the isolated Kolumbo strains is contrasted by their phenotypic diversity.During the third and fourth studies shotgun metagenomic sequencing methodologies were conducted with Illumina technology, that have the capacity to illuminate both the taxonomic diversity and the functional potential of the microbial communities. High molecular weight DNA was extracted from solid samples that were collected from the polymetallic hydrothermal chimneys of the Kolumbo crater floor and the Kallisti Limnes of the Santorini caldera (submarine pools created by the accumulation of the carbon dioxide released by hydrothermal activity. The total environmental DNA was sequenced using Illumina technology and the resulting sequences were assembled bioinformatically into larger contigs. Subsequently, the contigs were annotated (i.e. estimation of the identity and functional role of genes and the “reconstruction” of intricate cellular and metabolic pathways) with the IMG/ MER online platform. The functionally annotated gene sequences were analyzed to gain insights in the taxonomic and functional diversity of the sampled microbial communities. The metagenomic analyses were combined with bulk analyses for major and trace elements of the solid samples and quantified nutrient content analyses for water column samples.The metagenomic samples from Kolumbo were derived from three distinct layers from the external surface of an inactive hydrothermal chimney. The most abundant element was Fe (mean 2.07%), followed by high concentrations of S, Na, Pb, Mg, Ca and As (54,5 ppm – 1.09%). The communities from all three layers were dominated by unclassified bacteria from the Chloroflexi, Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, and the Planctomycetes lineages and by the thaumarchaeon Nitrosopumilus maritimus. According to the number of genes, the most abundant processes are ammonia oxidation performed by Nitrosopumilus and the oxidation of sulfur compounds performed by Gamma— and Alphaproteobacterial members. The potential Fe(II) oxidation is abundant in the inactive chimney and is performed by Zetaproteobacteria and by nitrate-reducing bacteria. Arsenite oxidizing genes are also abundant in the three metagenomes along with genes encoding cellular transport of metals like Fe, Hg, As and Cu. In total, the mineralogy of the polymetallic chimneys and the absence of hydrothermal activity have shaped stable microbial communities associated with bioleaching and biomineralization. Two metagenomic samples from the Kallisti Limnes subsea pools were analyzed: a pool water sample and a solid microbial mat sample. The Kallisti Limnes, in contrast to the surrounding seawater, is characterized by lower pH values, high concentrations of ammonium, nitrate and silicate and high values of elements such as Fe, S, Na and Mg and toxic metals such as Pb and As. Gammaproteobacteria, Chloroflexi, and Deltaproteobacteria are dominant, with only a small percentage of archaea present. Zetaproteobacteria are characterized by Fe(II) oxidation to obtain energy and by CO2 fixation with the Calvin-Benson-Bassham metabolic pathway. Zetaproteobacteria are more prevalent in the microbial mat where the more available oxygen is utilized as an electron acceptor. Microbial mat chemolithoautotrophs use sulfate reduction, sulfide oxidation and nitrate reduction coupled with sulfur compound oxidation to obtain energy, while chemolithoheterotrophs obtain their carbon through the degradation of aromatic hydrocarbons. The microbial communities are adapted to the high concentrations of toxic heavy metals like Pb, Co and Cd by employing detoxifying mechanisms. Overall, the Kallisti Limnes are characterized by Fe(II)-oxidizing Zetaproteobacteria that participate in the biogenic formation of oxyhydroxide precipitates. This dissertation on the microbial communities in the hydrothermal fields of the Kolumbo submarine volcano and the Santorini caldera elucidates the complex influence of active hydrothermal venting and geochemistry the community structure and functioning of microbial communities. The microorganisms play a major role in the biogeochemical cycling of common elements (C, S, N and H) and metals (Fe and As). Furthermore, the hydrothermal microbial communities influence the hydrothermal venting and sulfide mineral processes via the formation of seafloor mats and chimney biofilms.

Τα υποθαλάσσια υδροθερμικά πεδία χαρακτηρίζονται από την έκλυση θερμών και χημικά τροποποιημένων υδάτινων ρευστών διαλυμάτων, τα οποία παράγονται κάτω από το θαλάσσιο πυθμένα από την αλληλεπίδραση του εισερχόμενου θαλάσσιου νερού με τα πυριγενή πετρώματα. Η εκπομπή των υδροθερμικών ρευστών δημιουργεί χημικές και θερμικές βαθμίδες. Η αλληλεπίδραση των υδροθερμικών ρευστών με το θαλάσσιο νερό προκαλεί την απόθεση ορυκτών με τη μορφή υδροθερμικών καμινάδων και υβωμάτων. Οι χημειολιθότροφοι μικροοργανισμοί που αποικίζουν τις υδροθερμικές αποθέσεις και, καμινάδες, καθως και τους σχετιζόμενους μικροβιακούς τάπητες χρησιμοποιούν τα διαθέσιμα χημικά και ορυκτά υποστρώματα και δημιουργούν μικροβιακές κοινωνίες με υψηλή ταξινομική και μεταβολική ποικιλότητα. Ωστόσο, η κατανόηση μας, για το πως επηρεάζει η παρουσία ή απουσία ενεργούς έκλυσης υδροθερμικών ρευστών διαλυμάτων τις μικροβιακές κοινωνίες και για το πως οι κοινωνίες αυτές συμμετέχουν στο σχηματισμό πολυμεταλλικων θειούχων και άλλων ορυκτών, είναι περιορισμένη Με στόχο την κατανόηση της ποικιλότητας και της δομής των μικροβιακών κοινωνιών, τη μελέτη των μικροβιακών μεταβολικών δυνατότητων και την αλληλεπίδραση των μικροβιακών κοινωνιών με τη γεωχημεία και ορυκτολογία, κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής, δείγματα συλλέχθηκαν από το υδροθερμικό πεδίο του υποθαλάσσιου ηφαίστειου του Κολούμπου και της καλδέρας της Σαντορίνης και χρησιμοποιήθηκαν σε τέσσερις διασυνδεδεμένες μελέτες.Κατά την πρώτη μελέτη, διεξήχθη αλληλούχιση τύπου dual-index Illumina του 16S rRNA γονιδίου (amplicon sequencing) σε συνολικό περιβαλλοντικό DNA από μικροβιακές κοινωνίες σε ενεργές και ανενεργές υδροθερμικές θειούχες καμινάδες από το υδροθερμικό πεδίο του θαλάσσιου πυθμένα του Κολούμπου. Συνολικά 15.701 λειτουργικά ταξινομικές ομάδες (OTU) αποδόθηκαν σε 56 φύλα βακτηρίων και 3 φύλα αρχαίων και σε 133 και 16 κλάσεις βακτηρίων και αρχαίων, αντίστοιχα. OTU που σχετίζονται με θερμόφιλα μέλη των Epsilonproteobacteria, Aquificae and Deltaproteobacteria κυριάρχησαν τις μικροβιακές κοινωνίες από ενεργές καμινάδες. Ένα OTU που σχετίζεται στενά με το αρχαίο Nitrosopumilus spp. και OTU συγγενικά με Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Planctomycetes and Bacteroidetes κυριάρχησαν στις κοινωνίες ανενεργών καμινάδων. Οι ομάδες αυτές είναι στενά συγγενικές με φυλοτύπους που τυπικά εμπλέκονται στους κύκλους σιδήρου, θείου, αζώτου, υδρογόνου και μεθανίου. Συνολικά, οι ανενεργές καμινάδες παρουσίασαν ομοιόμορφες μικροβιακές κοινωνίες υψηλής ποικιλότητας, σε αντίθεση με τις κοινωνίες από ενεργές καμινάδες που κυριαρχούνται από χημειολιθότροφες και θερμόφιλες ομάδες. Στη δεύτερη μελέτη, δείγματα θαλάσσιου νερού συλλέχθηκαν από 8 διαφορετικά βάθη από το επιφανειακό (5-90 m)και βαθύ στρώμα (430-495 m) της θαλάσσιας στήλης πάνω από την υδροθερμικά ενεργή περιοχή του πυθμένα του κρατήρα του ηφαιστείου του Κολούμπου. Τα δείγματα νερού χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των θρεπτικών στοιχείων και για την καλλιέργεια και απομόνωση μεσόφιλων βακτηρίων με γεωμικροβιολογικό ενδιαφέρον και εν δυνάμει βιοτεχνολογική χρήση. Ένα σύνολο 232 βακτηριακών στελεχών απομονώθηκαν, τα οποία ανήκουν στα κατά Gram θετικά Bacilli και στα κατά Gram αρνητικά Alpha-, Beta- και Gammaproteobacteria. Το Pseudomonas είναι το πιο άφθονο γένος σε όλα τα απομονωμένα στελέχη στα νερά του Κολούμπου. Τα απομονωμένα στελέχη παρουσιάζουν μικρή φυλογενετική και ταξινομική ποικιλότητα σε αντίθεση με την υψηλή ποικιλότητα που έχει παρατηρηθεί σε μελέτες που δεν στηρίζονται σε καλλιέργειες από υδροθερμικές καμινάδες και ιζήματα. Η χαμηλή αυτή ποικιλότητα των στελεχών του Κολούμπου αντιπαραβάλλεται με την φαινοτυπική τους ποικιλότητα. Κατά τη διάρκεια της τρίτης και τέταρτης μελέτης εφαρμόστηκαν μεθοδολογίες μεταγονιδιώματος (shotgun metagenomics sequencing) με τεχνολογία Illumina που μπορούν να διαλευκάνουν τόσο τη ταξινομική δομή όσο και το λειτουργικό δυναμικό των μικροβιακών κοινοτήτων. DNA υψηλού μοριακού βάρους εξήχθη από στερεά δείγματα που συλλέχθηκαν από μεταλλοφόρες πολυμεταλλικές υδροθερμικές αποθέσεις από το ηφαίστειο του Κολούμπου και τις Λίμνες Καλλίστη της καλδέρας της Σαντορίνης (υποθαλάσσιες λίμνες που έχουν δημιουργηθεί από τη συσσώρευση του εκλυόμενου από την υδροθερμική δραστηριότητα διοξειδίου του άνθρακα). Το συνολικό DNA αλληλουχήθηκε με τη χρήση της τεχνολογίας Illumina. Οι επακόλουθες αλληλουχίες συναρμολογήθηκαν βιοπληροφορικά σε μεγαλύτερες συνεχόμενες αλληλουχίες (contigs). Ακολούθως, τα contigs σχολιάστηκαν, έγινε δηλαδή εκτίμηση της ταυτότητας και πρόβλεψη του λειτουργικού ρόλου των γονιδίων καθώς και «ανασύνθεση» των πολύπλοκων κυτταρικών και μεταβολικών μονοπατιών με τη διαδικτυακή πλατφόρμα IMG/MER. Οι λειτουργικά σχολιασμένες γονιδιωματικές αλληλουχίες αναλύθηκαν τόσο για τη διαλεύκανση της ταξινομικής όσο και της λειτουργικής ποικιλότητας των μικροβιακών κοινωνιών. Οι μεταγονιδιωματικές αναλύσεις συνδυάστηκαν με μαζική ανάλυση κύριων στοιχείων και ιχνοστοιχείων στα στερεά δείγματα και με μέτρηση των θρεπτικών στοιχείων στα δείγματα νερού από την υδάτινη στήλη. Τα δείγματα μεταγονιδιωμάτων από το Κολούμπο προέρχονται από τρία διακριτά στρώματα του επιφανειακού μέρους μιας ανενεργής υδροθερμικής καμινάδας. Το πιο άφθονο στοιχείο και στα τρία στρώματα ήταν ο σίδηρος (μ.ο. 2, 07%), ενώ τα στοιχεία του θείου, νατρίου, μόλυβδου, μαγνησίου, ασβεστίου και αρσενικού εμφάνισαν ακολούθως υψηλές συγκεντρώσεις (54,5 ppm – 1.09%). Οι μικροβιακές κοινωνίες και στα τρία στρώματα κυριαρχούνταν από βακτήρια των φύλων Chloroflexi, Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, και Planctomycetesι ενώ ως προς τα αρχαία χαρακτηριστική ήταν η παρουσία του Nitrosopumilus maritimus. Σε αριθμό γονιδίων, η πιο άφθονη λειτουργία ήταν η οξείδωση της αμμωνίας από το Nitrosopumilus και η οξείδωση συμπλόκων του θείου που διεξάγονται από τα Gamma- και Alphaproteobacteria. Η οξείδωση δισθενούς σιδήρου είναι άφθονη στην ανενεργή καμινάδα και εν δυνάμει διεξάγεται από τα Zetaproteobacteria και από βακτήρια που οξειδώνουν νιτρικά. Άφθονα είναι επίσης τα γονίδια οξείδωσης του αρσενικού μαζί με τα γονίδια κυτταρικής μεταφοράς μετάλλων όπως ο σίδηρος, ο υδράργυρος, το αρσενικό και ο χαλκός. Συνολικά, η ορυκτολογία των πολυμεταλλικών καμινάδων και η απουσία υδροθερμικής δραστηριότητας έχουν διαπλάσσει αδιατάρακτες μικροβιακές κοινωνίες που παίρνουν μέρος σε διαδικασίες βιο-προσρόφησης και βιο-ορυκτοποίησης.Δύο μεταγονιδιωματικά δείγματα αναλύθηκαν από τις υποθαλάσσιες λίμνες Καλλίστη: ένα υγρό δείγμα της λίμνης και ένα δείγμα από τους περιβάλλοντες μικροβιακούς τάπητες. Οι λίμνες Καλλίστη χαρακτηρίζονται από χαμηλές τιμές pH, χαμηλές συγκεντρώσεις αμμώνιου, νιτρικών και πυριτικών, καθώς και υψηλές τιμές στοιχείων όπως ο σίδηρος, θείο, νάτριο και μαγνήσιο και βαρέων μετάλλων όπως ο μόλυβδος και το αρσενικό. Ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε πως επικρατούν βακτήρια από τις ομάδες των Gammaproteobacteria, Chloroflexi, και Deltaproteobacteria με πολύ μικρά ποσοστά αρχαίων. Τα Zetaproteobacteria χαρακτηρίζονται μεταβολικά από την οξείδωση σιδήρου για απόκτηση ενέργειας και από τη δέσμευση διοξειδίου του άνθρακα μέσω του μεταβολικού μονοπατιού Calvin-Benson-Bassham για τη δέσμευση διοξειδίου του άνθρακα. Τα Zetaproteobacteria κυριαρχούν στο μικροβιακό τάπητα όπου μπορούν να χρησιμοποιήσουν το διαθέσιμο οξυγόνο ως δέκτη ηλεκτρονίων. Χημειολιθότροφα βακτήρια χρησιμοποιούν αναγωγή θειικών, οξείδωση θειούχων και αναγωγή νιτρικών και οξείδωση συμπλόκων θείου για απόκτηση ενέργειας. Χημειολιθοετερότροφα βακτήρια αποκτούν άνθρακα από την αποδόμηση αρωματικών υδρογονανθράκων. Οι μικροβιακές κοινωνίες έχουν προσαρμοστεί στις υψηλές συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων όπως Pb, Co και Cd με τη χρήση αποτοξινωτικών μηχανισμών. Συνολικά, οι λίμνες Καλλίστη χαρακτηρίζονται από σίδηρο-οξειδωτικά Zetaproteobacteria που συμμετέχουν στο βιογενή σχηματισμό όξυ-υδροξειδίων του σιδήρου .Η παρούσα διατριβή στις μικροβιακές κοινωνίες των υδροθερμικών πεδίων από το ηφαίστειο του Κολούμπου και της καλδέρας της Σαντορίνης διαφωτίζει την επιρροή της ενεργής απορροής υδροθερμικών ρευστών και της γεωχημείας στη δομή και λειτουργία των μικροβιακών κοινωνιών. Οι μικροοργανισμοί παίζουν σημαντικό ρόλο στους βιογεωχημικούς κύκλους κοινών στοιχείων (C, S, N και H) και μετάλλων (Fe and As). Τέλος, οι υδροθερμικές μικροβιακές κοινωνίες επηρεάζουν την υδροθερμική απορροή και τις διεργασίες θειούχων ορυκτών μέσω του σχηματισμού ταπήτων στο θαλάσσιο πυθμένα και βιοϋμένια στις καμινάδες.