Μελέτη έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την υποξία των όγκων στον καρκίνο του νεφρού

Abstract

Kidney cancer accounts for 2‑3% of all malignancies in adults and is the 12th most common cancer type worldwide. Cancer cells, with their specific genetic and epigenetic mechanisms, can adapt to these hypoxic conditions. This is partly achieved by regulation of gene products in response to hypoxia. A number of these hypoxia‑regulated genes require the mediation of hypoxia inducible factors (HIF). Under normoxia condition, HIF‑1α and HIF‑2α are continuously expressed and degraded. Degradation is mediated by the prolyl hydroxylases (PHD). The present study investigated the possible involvement of the HIF/PHD pathway in RCC by evaluating HIF‑1α, HIF‑2α, PHD1, PHD2 and PHD3 mRNA expression levels using real time quantitative PCR (qPCR). In addition, as little is known about the hypoxia pathway in a large group of benign kidney tumours, the oncocytomas, we compared the expression differences in the HIF/PHD pathway between ccRCC and oncocytomas. Quantitative PCR was used to quantify the mRNA expression levels of HIF‑1α, HIF‑2α, prolyl hydroxylase (PHD)1, PHD2 and PHD3 in both formalin‑fixed paraffin‑embedded (FFPE) and fresh frozen tumour tissue samples from 48 patients, including 41 cases of RCC and 7 cases of oncocytoma. Samples of corresponding adjacent normal kidney tissues for each individual were used as a comparison. mRNA expression levels were analysed regarding clinical parameters, histological type, stage, nuclear grade, cancer specific survival and overall survival. PHD3 mRNA overexpression was recorded in 87.87% (29/33) of the ccRCC FFPE samples. HIF‑1α levels were decreased in 16/33 (48.48%) cases of ccRCC, while HIF‑2α did not exhibit a specific pattern. In addition, PHD1 and PHD2 transcript levels were similar in the majority of patients. With regard to pathological parameters, PHD3 expression levels were inversely associated with Fuhrman grade (P=0.015) in ccRCC cases. No other association was recorded between mRNA expression levels and tumour stage, presence of necrotic or presence of sarcomatous elements. Regarding the oncocytoma cases, 71.45% of cases showed low, with the remaining cases showing medium expression levels of PHD3. There was no difference in expression levels for HIF-1α, HIF-2α, PHD1 and PHD2 between RCC and oncocytoma. In comparison with oncocytoma cases, PHD3 mRNA levels were significantly upregulated (P<0.001) in ccRCC. To the best of our knowledge, this is the first study to identify a correlation between PHD3 expression level and the aggressiveness of tumour cells, suggesting a crucial involvement of PHD3 in ccRCC. The central role of PHD3 in the carcinogenesis of ccRCC is further revealed by the findings of the present study. When the expression of the five interrogated genes (HIF-1α, HIF-2α, PHD1, PHD2 and PHD3) was compared between oncocytomas and ccRCC, only PHD3 was found to be significantly upregulated in ccRCC, identifying the upregulation of PHD3 as the possible underlying difference in the behaviour of ccRCC. In conclusion, the present study demonstrated that PHD3 may play an important role in the valuable host molecular adaptation that occurs during oxidative stress in ccRCC.

Ο καρκίνος του νεφρού αντιπροσωπεύει το 2‑3% όλων των κακοηθειών σε ενήλικες και είναι ο 12ος πιο κοινός τύπος καρκίνου παγκοσμίως. Τα καρκινικά κύτταρα με γενετικούς και επιγενετικούς μηχανισμούς, έχουν την ικανότητα να προσαρμόζονται σε αυτές τις υποξικές συνθήκες, τόσο στην πρωτοπαθή όσο και στις μεταστατικές εστίες. Μέρος αυτής της προσαρμογής είναι και η ρύθμιση προϊόντων γονιδίων ως απάντηση στην υποξία. Πολλά από αυτά τα ρυθμιζόμενα από την υποξία γονίδια απαιτούν τη μεσολάβηση των επαγόμενων από την υποξία παραγόντων (HIF). Υπό συνθήκες νορμοξίας, οι HIF-1α και HIF‑2α εκφράζονται συνεχώς και αποδομούνται. Η αποδόμηση προκαλείται από τις προλυλο - υδροξυλάσες (PHD). Η παρούσα μελέτη διερεύνησε την πιθανή εμπλοκή του μονοπατιού HIF / PHD στον νεφροκυτταρικό καρκίνο, αξιολογώντας τα επίπεδα mRNA έκφρασης HIF‑1α, HIF‑2α, PHD1, PHD2 και PHD3, χρησιμοποιώντας μια προηγμένη μέθοδο, την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR). Επιπλέον, συγκρίναμε τις διαφορές έκφρασης HIF / PHD μεταξύ διαυγοκυτταρικού νεφροκυτταρικού καρκίνου (ccRCC) και των ογκοκυττωμάτων. Η qPCR χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης mRNA των HIF‑1α, HIF‑2α, PHD1, PHD2 και PHD3 και σε δείγματα παραφίνης και σε νωπά κατεψυγμένα δείγματα όγκου από 48 ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων 41 περιπτώσεων RCC και 7 περιπτώσεων ογκοκυττωμάτων. Η έκφραση συσχετίστηκε σε όλα τα δείγματα, με την έκφραση των γονιδίων σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό για όλα τα περιστατικά. Τα επίπεδα mRNA έκφρασης, αναλύθηκαν σχετικά με τις κλινικές παραμέτρους των ασθενών, τον ιστολογικό τύπο, το στάδιο της νόσου, τον πυρηνικό βαθμό ατυπίας και την ειδική για καρκίνο και συνολική επιβίωση. Υπερέκφραση PHD3 mRNA καταγράφηκε στο 87,87% (29/33) των δειγμάτων ccRCC. Τα επίπεδα HIF‑1α μειώθηκαν σε 16/33 (48,48%) περιπτώσεις ccRCC, ενώ ο HIF‑2α δεν παρουσίασε ένα συγκεκριμένο πρότυπο έκφρασης. Επιπλέον, τα επίπεδα μεταγραφής PHD1 και PHD2 ήταν παρόμοια στην πλειονότητα των ασθενών. Όσον αφορά τις παθολογοανατομικές παραμέτρους, τα επίπεδα έκφρασης PHD3, συσχετίστηκαν αντιστρόφως με τον βαθμό Fuhrman (p=0.015) σε περιπτώσεις ccRCC. Δεν καταγράφηκε άλλη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης mRNA και του σταδίου του όγκου, της παρουσίας νεκρωτικών ή σαρκωματωδών στοιχείων. Όσον αφορά τις περιπτώσεις ογκοκυττωμάτων, το 71.45% παρουσίασε χαμηλή, με τις υπόλοιπες περιπτώσεις να εμφανίζουν επίπεδα μέσης έκφρασης PHD3. Δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα έκφρασης για HIF-1α, HIF-2α, PHD1 και PHD2 μεταξύ RCC και ογκοκυττωμάτων. Αντίθετα, σε σύγκριση με τα ογκοκυττώματα, τα επίπεδα mRNA έκφρασης του PHD3 βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα (P<0.001) στο ccRCC. Από όσα γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αναδεικνύει συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του PHD3 και της επιθετικότητας των καρκινικών κυττάρων, υποδηλώνοντας μια κρίσιμη συμμετοχή της PHD3 στο ccRCC. Αυτός ο κεντρικός ρόλος του PHD3 στην καρκινογένεση του ccRCC αποκαλύπτεται περαιτέρω από τα ευρήματα της παρούσας μελέτης. Όταν συγκρίθηκε η έκφραση των πέντε υπό μελέτη γονιδίων μεταξύ ογκοκυττωμάτων και ccRCC, μόνο ο PHD3 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σημαντικά στο ccRCC, προσδιορίζοντας την αύξηση της ρύθμισης του PHD3, ως την πιθανή υποκείμενη διαφορά στη συμπεριφορά του ccRCC. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ο PHD3 μπορεί να διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην μοριακή προσαρμογή που συμβαίνει κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες στο ccRCC.