Laboratory diagnostic approach to canine infectious diseases of wildlife and public health importance

Abstract

This thesis aimed to investigate specific canine infectious diseases of wildlife and public health significance by a laboratory diagnostic approach, combining laboratory techniques and environmental niche modelling, where it was considered appropriate. To this end, samples from diarrhoeic dogs were tested for the presence of Canine Parvovirus and Salmonella spp. Also, samples from European Brown hares were tested for the presence of Salmonella spp. only, as Canine Parvovirus strains prefer the carnivora as hosts. Canine Parvovirus is a pathogen of importance for dogs and other wild carnivore species while Salmonella spp. remain the second cause of human gastroenteritis cases in the EU; thus means that is of major Public Health importance.In the first chapter of this study, the international literature was critically reviewed, and health risks associated with human animal interactions were presented. More specifically, enteric pathogens of zoonotic risk which are transmitted by faeces of dogs and cats were referred in groups (Parasites/ Protozoa/ Bacteria/Viruses). Among them, Salmonellae, Campylobacter, Rotaviruses, Toxoplasma gondii, Echinococcus are of significant for many countries including Greece. The evaluation of the diagnostic accuracy of a commercial diagnostic tool for the detection of Canine Parvovirus is described in the second chapter. The rapid in-clinic test was compared with an established PCR method, which is considered as the most reliable diagnostic method. 78 faecal samples were collected from diarrhoeic dogs. Implementation of vaccination within a month prior to the onset of diarrhoea was reported for 12 of the sampled dogs. The rapid diagnostic test was performed in 23 of the faecal samples directly, while the rest were placed into a sterile swab and stored at −20 ◦C. The sensitivity of the rapid diagnostic test compared to PCR in the total number of samples, in samples from non-vaccinated dogs and in samples tested directly after collection were 22.22% (95% CI: 13.27–33.57%), 26.67% (95% CI: 16.08–39.66%) and 76.47% (95% CI: 50.10–93.04%) respectively, while the specificity of the test was 100% in any case. Based on these results, it can be argued that negative results do not exclude parvoenteritis, especially in dogs with early vaccination history, but a positive result almost certainly indicates CPV infection. The test should be conducted directly in order to expect improved sensitivity.In the third chapter, we aimed to investigate the presence of Canine Parvovirus in dogs with compatible clinical signs in Central Greece, to identify demographic and environmental factors associated with CPV infection, A total of 117 faecal samples were collected from diarrhoeic dogs and were tested for a fragment of VP2 capsid gene. Multivariate logistic regression, using R program, revealed that significant factors identified were age and utility of dogs (work dogs more probable to be positive versus pet-dogs). Geographical information system (GIS) together with the Ecological Niche Model (ENM) showed that the most important findings of the study were (i) Central plain of Thessaly were identified as high risk geographical areas, (ii) Livestock density (iii) land uses and specifically the category: discontinuous urban fabric and human population density are the most significant environmental parameters as risk factors according to the maximum entropy model. The last chapter concerns the detection of Salmonella spp., an important zoonotic pathogen in dogs and European Brown Hare, which is an important game species, in Thessaly. 50 samples (liver tissue) from hares hunted in Central Greece and 117 samples (faecal swabs) from dogs were examined for Salmonella using a validated PCR protocol (Malorny et al. 2003). Also, a spatial analysis using GIS was conducted to investigate possible geographical distribution and environmental risk factors, associated with Salmonella presence. 10 hares out of 50 and 8 out of 117 dogs were found to be Salmonella positive. GIS analysis using Max Entropy Montel showed that risk for the exposure to Salmonella in hares are driven by environmental parameters; precipitation seasonality, precipitation of the coldest quarter and livestock density being the most significant. Respectively, for dogs being positive to Salmonella and its potential distribution, the significant environmental parameters were: maximum temperature of the warmest month, mean temperature of warmest quarter of the year, livestock density and normalized difference vegetation index (NDVI) for August. Livestock density is an environmental parameter which is shared between dogs and hares positive to Salmonella, indicating that there is a probable spill-over among farm animals, dogs and wildlife. This study, which is the first of this kind from Greece, suggests that the role of hares and dogs in Salmonella shedding and transmission deserves further elucidation.This thesis provides evaluation of existing diagnostic methods for parvoenteritis, which is present in the canine population of the Greek mainland. It also explores the association of CPV presence in diarrhoeic dogs with certain demographic and environmental factors. Apart from that, the Salmonella presence in diarrhoeic dogs and hares is reported and associated with environmental factors which differ between the two animal species, suggesting that in this case the different habits of the hosts are depicted. The continuous surveillance of canine populations in combination with targeted wildlife species could provide information on the pathogens (especially zoonotic) circulating posing risk for wildlife, domestic animals and humans.

Ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη ορισμένων λοιμωδών νοσημάτων του σκύλου, ιδιαίτερης σημασίας για την άγρια πανίδα και τη Δημόσια Υγεία μέσω διαγνωστικής εργαστηριακής προσέγγισης, συνδυάζοντας εργαστηριακές τεχνικές και οικολογικού μοντέλου θέσης, όπου αυτό κρίθηκε απαραίτητο. Για το σκοπό αυτό, δείγματα από σκύλους που παρουσίαζαν διάρροια εξετάστηκαν για την εύρεση του ιού Canine Parvovirus και σαλμονέλλας. Επίσης, δείγματα από ευρωπαϊκούς καφετί λαγούς εξετάστηκαν για την παρουσία σαλμονέλλας, εφόσον τα στελέχη Canine Parvovirus προτιμούν ως ξενιστές σαρκοφάγα είδη. Ο ιός Canine Parvovirus επιλέχθηκε ως παθογόνος παράγοντας με ιδιαιτέρη σημασία για τους σκύλους και άλλα άγρια είδη σαρκοφάγων ενώ η Σαλμονέλλα παραμένει η δεύτερη συχνότερη αιτία γαστρεντερίτιδας σε ανθρώπους στην Ευρωπαϊκή Ένωση, δηλαδή αποτελεί παθογόνο παράγοντα με μεγάλη σημασία για τη Δημόσια Υγεία. Στο πρώτο κεφάλαιο της μελέτης, έγινε κριτική ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας και παρουσιάστηκαν κίνδυνοι για την ανθρώπινη υγεία που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση ανθρώπων και ζώων. Πιο συγκεκριμένα, ζωονοτικοί παθογόνοι παράγοντες που εντοπίζονται στον εντερικό σωλήνα και μπορούν να μεταδοθούν μέσω των κοπράνων παρουσιάστηκαν σε κατηγοριοποίηση (Παράσιτα/ Πρωτόζωα/ Βακτήρια/ Ιοί). Μεταξύ αυτών, στελέχη Salmonellae, Campylobacter, ροταϊοί, Toxoplasma gondii και ο εχινόκοκκος αποτελούν πρόβλημα σε πολλές χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ελλάδας. Η εκτίμηση της διαγνωστικής ακρίβειας μιας εμπορικής διαγνωστικής μεθόδου για την ανίχνευση του Canine Parvovirus περιγράφεται στο δεύτερο κεφάλαιο. Γίνεται σύγκριση της ταχείας εμπορικής δοκιμής με συγκεκριμένη PCR μέθοδο, που θεωρείται η πιο αξιόπιστη μέθοδος για την ανίχνευση του ιού. 78 δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από σκύλους με διάρροια. Σε 12 σκύλους αναφέρθηκε εμβολιασμός σε διάστημα ενός μήνα πριν την έναρξη των συμπτωμάτων. Η ταχεία δοκιμή έγινε σε 23 δείγματα άμεσα, ενώ τα υπόλοιπα αποθηκεύτηκαν στους -20◦C. Η ευαισθησία της εμπορικής μεθόδου σε σχέση με την PCR ήταν 22.22% (95% CI: 13.27–33.57%) όσον αφορά το σύνολο των δειγμάτων, στα δείγματα από μη εμβολιασμένους σκύλους 26.67% (95% CI: 16.08–39.66%) και στα δείγματα που εξετάστηκαν αμέσως μετά τη συλλογή τους 76.47% (95% CI: 50.10–93.04%). Η ειδικότητα της δοκιμής ήταν 100%. Σύμφωνα με τα προαναφερθέντα αποτελέσματα, εξάγεται το συμπέρασμα ότι τα αρνητικά αποτελέσματα της ταχείας δοκιμής δεν αποκλείουν την ύπαρξη του ιού, αλλά το θετικό αποτέλεσμα σχεδόν σίγουρα υποδηλώνει μόλυνση από CPV. Η ταχεία δοκιμή είναι προτιμότερο να διεξάγεται, αμέσως μετά τη συλλογή των δειγμάτων.Στο τρίτο κεφάλαιο, στόχος ήταν η ανίχνευση της παρουσίας του ιού Canine Parvovirus σε σκύλους με συμβατά κλινικά συμπτώματα στην Κεντρική Ελλάδα καθώς και η διαπίστωση ύπαρξης δημογραφικών και περιβαλλοντικών παραγόντων που ενδέχεται παίζουν κάποιο ρόλο στην εμφάνιση του. Συνολικά εξετάστηκαν 117 δείγματα κοπράνων σκύλων έναντι ενός τμήματος του γονιδίου VP2. Η πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση, με τη χρήση του προγράμματος R, έδειξε ότι οι παράγοντες που σχετίζονται με την εμφάνιση του ιού είναι η ηλικία και η χρήση του σκύλου (οι σκύλοι εργασίας είναι πιο πιθανό να μολυνθούνε από ότι οι σκύλοι αμιγώς συντροφιάς). Τα ευρήματα του Γεωγραφικού Πληροφοριακού Συστήματος μαζί με το οικολογικό μοντέλο θέσης ήταν τα εξής: (i) η πυκνότητα του κτηνοτροφικού κεφαλαίου και (ii) οι χρήσεις γης (συγκεκριμένα ο διακεκομμένος αστικός ιστός) και η πυκνότητα ανθρώπινου πληθυσμού αναγνωρίζονται ως οι πιο σημαντικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες για την εμφάνιση του ιού. Το τελευταίο κεφάλαιο αφορά την ανίχνευση Salmonella spp., ενός σημαντικού ζωονοτικού παθογόνου, σε σκύλους και ευρωπαϊκούς καφετί λαγούς, ενός διαδεδομένου είδους θηράματος. 50 δείγματα από θηρευμένους λαγούς και 117 δείγματα σκύλων από την Κεντρική Ελλάδα εξετάστηκαν με αξιολογημένη μέθοδο PCR. Επιπλέον, έγινε χωρική ανάλυση με τη χρήση ΓΠΣ για τη διερεύνηση της πιθανής γεωγραφικής κατανομής και των σημαντικών περιβαλλοντικών παραγόντων για την παρουσία του βακτηρίου. Βρέθηκαν θετικοί 10 από τους λαγούς και 8 από τα 117 δείγματα σκύλων. Η ανάλυση ΓΠΣ μαζί με το μοντελοποίηση ειδών έδειξε τα εξής: για τους λαγούς σημαντικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες ήταν η εποχικότητα της βροχόπτωσης, η βροχόπτωση κατά το πιο ψυχρό τρίμηνο του έτους και η πυκνότητα του κτηνοτροφικού κεφαλαίου. Αντιστοίχως, για σκύλους θετικούς στη σαλμονέλλα σημαντικοί βρέθηκαν: η μέγιστη θερμοκρασία του πιο θερμού μήνα, η μέση θερμοκρασία του πιο θερμού μήνα, η πυκνότητα του κτηνοτροφικού κεφαλαίου και ο δείκτης βλάστησης για τον Αύγουστο. Η πυκνότητα του κτηνοτροφικού κεφαλαίου είναι ένας κοινός παράγοντας που σχετίζεται με την παρουσία σαλμονέλλας και στα δύο ζωικά είδη, υποδεικνύοντας ότι ενδεχομένως υπάρχει μετάδοση του παθογόνου μεταξύ των παραγωγικών ζώων, των σκύλων και της άγριας πανίδας. Αυτή η μελέτη, που έγινε για πρώτη φορά στην Ελλάδα υποδηλώνει ότι ο ρόλος των λαγών και τον σκύλων στην απέκκριση και μετάδοση των Salmonellae χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, έγινε εκτίμηση μιας εμπορικά διαθέσιμης διαγνωστικής μεθόδου για την παρβοεντερίτιδα, η οποία είναι ακόμα παρούσα στην ηπειρωτική Ελλάδα. Εξερευνά επίσης τη σχέση μεταξύ της παρουσίας του ιου CPV με συγκεκριμένους δημογραφικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Επίσης, η παρουσία της σαλμονέλλας ανιχνεύεται σε σκύλους με διάρροια και λαγούς, ενώ συνδέεται με περιβαλλοντικούς παράγοντες, οι οποίοι διαφοροποιούνται μεταξύ των δύο ζωικών ειδών, υποδεικνύοντας ότι σε αυτή την περίπτωση αντανακλώνται οι συνήθειες των ξενιστών. Η συνεχής επιτήρηση των πληθυσμών σκύλων σε συνδυασμό με στοχευμένους πληθυσμούς ειδών άγριας πανίδας είναι δυνατό να δώσουν πληροφορίες για παθογόνους παράγοντες (ειδικά ζωονοτικούς) που κυκλοφορούν αποτελώντας κίνδυνο για την άγρια πανίδα, τα κατοικίδια ζώα και τους ανθρώπους.