Mechanisms of genomic stability maintenance in fission yeast

Abstract

DNA replication consists of two distinct steps: the licensing step during the G1 phase and the initiation step at the G1 to S transition point. During licensing, two inactive complexes of the replicative helicases, MCMs, are loaded onto all the potential origins of replication (ORIs), through the combined action of Cdt1 and Cdc18. In a next step, a small subset of the licensed origins is activated in order to achieve timely duplication of the genome in the timeframe of S. The subset of origins activated in each cell cycle constitute the replication program of the cell. Despite the fact that origin selection is characterized by stochasticity, there are several parameters affecting the process and among them, nuclear architecture and the 3D genome structure are critical. In the present study, we set out to investigate the implication of the latter parameters in the replication program, using the model organism S. pombe. Combining genome-wide datasets regarding the exact position and the activation frequency per cell cycle (efficiency) for each origin with the 3D genome model in S. pombe, we noticed a spatial compartmentalization between efficient and inefficient origins, with the former presenting a position bias towards centromeres, which are clustered and anchored at a specific point of the nuclear membrane. Immunofluorescence experiments against IdU in wild type and mutant cells carrying unclustered centromeres (Csi1Δ), that allow capturing of early initiation events during replication, indicated that centromere mislocalization disrupts the spatial pattern of origin firing during early S. Next, in order to experimentally validate our initial, model-derived observation, efficient and inefficient ORIs, residing in all the three chromosomes, were tagged using the lacO-lacI system and their distance from centromeres in the 3D space of the nucleus was measured at the single cell level, employing confocal microscopy. The firing efficiencies of the respective origins were measured by Real-time qPCR and correlated to the distances. Our results experimentally confirmed a negative correlation between the ORI-centromere distance and the origin efficiency. In order to elucidate the molecular basis of this negative correlation, we investigated a possible, additional role for the master regulator of the replication program, Rif, in the 3D organization of the ORIs within the nucleus. To that end, the 3D distances of the tagged ORIs in respect to centromeres were measured for wild type and Rif1Δ cells. We noticed that, Rif1 selectively affects the positioning of Rif1-regulated ORIs, pointing to a differential role for the protein in chromatin organization. The temporal separation between licensing and initiation ensures the once and only once duplication of the genome and is achieved through the tight regulation over Cdt1 and Cdc18, which restricts their activity in the G1 phase. Deregulation of Cdt1 and Cdc18 leads to re-replication, a process generating multiple copies of specific parts of the genome. Another phenomenon related to increased copies of specific genomic segments are the Copy Number Gains (CNGs). In order to establish a cause and effect relationship between re-replication and CNGs, an inducible cdc18 overexpressing cell strain was exploited. Re-replication was induced and the incidence of CNG formation was monitored following specific genomic loci that are able to confer drug resistance when present in multiple copies. Our results indicated that, indeed, re-replication drives the formation of CNGs. Whole genome sequencing analysis of resistant clones indicated that CNGs are present in the form of Mb-long, extrachromosomal inverted repeats. Finally, to elucidate the DNA damage repair mechanisms that mediate the formation of CNGs upon re-replication induction, the incidence of re-replication induced CNGs was measured in mutant strains, bearing specific repair pathways inactivated. We noticed that the multiple copies generated by re-replication are converted into stable, inheritable genotypes through various Homologous Recombination-related repair pathways acting in a locus-specific manner.DNA replication is critical for cell survival. Therefore, elucidating both its regulation under normal conditions and its implications upon deregulation, could help us understand the molecular basis of related diseases and facilitate the development of more successful treatment methods.

Η διαδικασία της αντιγραφής του γενετικού υλικού αποτελείται από δυο διακριτά στάδια: το στάδιο της αδειοδότησης κατά την διάρκεια της G1 φάσης και το στάδιο της έναρξης κατά την μετάβαση από την G1 στην S φάση. Κατά την αδειοδότηση οι παράγοντες Cdt1 και Cdc18 στρατολογούν δυο ανενεργά σύμπλοκα των αντιγραφικών ελικασών, MCM, σε κάθε πιθανή αφετηρία της αντιγραφής. Στην συνέχεια, ένα μικρό υποσύνολο των αδειοδοτημένων αφετηριών ενεργοποιείται κατά την S προκειμένου να επιτευχθεί η έγκαιρη αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος. Παρά το γεγονός ότι η επιλογή των αφετηρίων χαρακτηρίζεται σε ένα βαθμό από στοχαστικότητα, αρκετοί είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την διαδικασία, και ανάμεσα σε αυτούς σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η αρχιτεκτονική του πυρήνα και η τρισδιάστατη διαμόρφωση της χρωματίνης μέσα σε αυτόν. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω παραγόντων στο πρόγραμμα της αντιγραφής, χρησιμοποιώντας τον οργανισμό μοντέλο S. pombe. Συνδυάζοντας δεδομένα που αφορούν την ακριβή θέση αλλά και την συχνότητα ενεργοποίησης (αποδοτικότητα) κάθε αφετηρίας, με το μοντέλο της τρισδιάστατης δομής του γονιδιώματος του S. pombe, παρατηρήσαμε μια χωρική διάκριση μεταξύ των αποδοτικών και μη αφετηριών, με τις πρώτες να οργανώνονται γύρω από την δομή των κεντρομερών, τα οποία βρίσκονται αγκυροβολημένα σε μια συγκεκριμένη θέση της πυρηνικής μεμβράνης. Πειράματα ανοσοφθορισμού που επιτρέπουν την παρατήρηση της πυροδότησης αφετηριών νωρίς στην S φάση, σε κύτταρα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα που παρουσιάζουν μη φυσιολογική τοποθέτηση των κεντρομερών, υπέδειξαν ότι η μη σωστή διάταξη των τελευταίων επηρεάζει τον τρόπο διεξαγωγής της αντιγραφής στον χώρο. Στην συνέχεια, προκειμένου να επιβεβαιώσουμε πειραματικά την αρχική μας παρατήρηση, επισημάνθηκαν συγκεκριμένες αποδοτικές και μη αποδοτικές θέσεις έναρξης της αντιγραφής σε κάθε ένα από τα τρία χρωμοσώματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα lacO-lacI, και η απόσταση τους από τα κεντομερή υπολογίστηκε στον τρισδιάστο χώρο του πυρήνα χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Οι αποδοτικότητες έναρξης των αντίστοιχων αφετηριών υπολογίστηκαν με την χρήση ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο και συσχετίστηκαν με τις παραπάνω αποστάσεις. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ της απόστασης των αφετηριών από τα κεντρομερή και της αποδοτικότητάς τους. Προκειμένου να διαλευκάνουμε τη μοριακή βάση της σχέσης χωροδιάταξης-αποδοτικότητας των αφετηριών, διερευνήσαμε ένα πιθανό ρόλο του κύριου ρυθμιστή της αντιγραφής, Rif1, στην οργάνωση τους στον τρισδιάστατο χώρο του πυρήνα. Για το λόγο αυτό, οι αποστάσεις από τα κεντρομερή των ήδη σημασμένων αφετηριών υπολογίστηκαν σε κύτταρα αγρίου τύπου και Rif1Δ κύτταρα. Πράγματι, η πρωτεΐνη Rif1 επηρεάζει επιλεκτικά την θέση των αφετηριών που ρυθμίζει, υποδεικνύοντας έναν διαφορικό ρόλο του μορίου σαν οργανωτή της χρωματίνης. Η χρονική διάκριση μεταξύ του σταδίου της αδειδότησης και της έναρξης της αντιγραφής διασφαλίζει την μια και μόνο μια φορά αντιγραφή του γενετικού υλικού σε κάθε κύκλο και επιτυγχάνεται μέσω του περιορισμού της ενεργότητας του Cdt1 και Cdc18 στην G1 φάση. Απορρύθμιση της έκφρασής τους οδηγεί σε επαναντιγραφή και σε αυξημένο αριθμό αντιγράφων συγκεκριμένων τμημάτων του γονιδιώματος. Ένα άλλο φαινόμενο που σχετίζεται με την εμφάνιση επιπλέον αντιγράφων, είναι η γονιδιακή ενίσχυση. Για την στοιχειοθέτηση μιας σχέση αιτίας-αποτελέσματος μεταξύ των δυο φαινομένων χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά με ικανότητα επαγόμενης υπέρκφρασης του cdc18. Προκλήθηκε επαγωγή επαναντιγραφής και η συχνότητα εμφάνισης αυξημένου αριθμού αντιγράφων παρατηρήθηκε μέσω γονιδίων, ικανών να προσδίδουν ανθεκτικότητα σε πολλαπλά αντίγραφα. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η επαναντιγραφή επάγει άμεσα την αυξημένου αριθμού αντιγράφων. Αλληλούχιση πλήρους γονιδιώματος σε ανθεκτικούς κλώνους υπέδειξε την εμφάνιση αυξημένων αντιγράφων με την μορφή μεγάλων, εξωχρωμοσωμικών ανεστραμμένων επαναλήψεων. Τέλος, προκειμένου να διαλευκάνουμε τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων που διαμεσολαβούν τον σχηματισμό των γονιδιωματικών αλλαγών μετά από επαναντιγραφή, η συχνότητα εμφάνισής των τελευταίων προσδιορίστηκε σε μεταλλάγματα που φέρουν απενεργοποιημένα συγκεκριμένα μονοπάτια επιδιόρθωσης κάθε φορά. Παρατηρήσαμε ότι, τα πολλαπλά αντίγραφα που προκύπτουν μέσω επαναντιγραφής, μετατρέπονται σε σταθερές γονιδιωματικές δομές μέσω διάφορων μονοπατιών του μηχανισμού επιδιόρθωσης του ομόλογου ανασυνδιασμού, τα οποία δρουν διαφορικά ανάλογα με τον γενετικό τόπο που ενισχύεται κάθε φορά. Η αντιγραφή του γενετικού υλικού αποτελεί μια από τις σημαντικότερες διεργασίες στη ζωή του κυττάρου και ως εκ τούτου η διαλεύκανση των μηχανισμών ρύθμισης κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, αλλά και των επιπτώσεων της απορρύθμισής τους, θα μπορούσαν να συμβάλλουν σημαντικά στην βαθύτερη κατανόηση της βιολογίας σχετιζόμενων ασθενειών και την ανάπτυξη πιο αποδοτικών θεραπειών για αυτές.