The impact of dietary choline-deprivation on kidneys and heart of stz-induced diabetic rats

Abstract

Choline (Ch) is an essential nutrient involved in a wide variety of metabolic reactions and functions, in both humans and rodents. Besides being a component of various important biological compounds (including the membrane phospholipids lecithin, sphingomyelin and plasmalogen, the neurotransmitter acetylcholine and the platelet activating factor), Ch is involved in many physiological functions (i.e. methyl groups metabolism, lipid transport, second messengers‟ generation, etc). Thus, Ch is of paramount importance for the optimal development and function of a number of organs and biological systems among which is the cardiovascular system and the kidneys.Ch-deprivation has received considerable attention due to its association with adverse health outcomes that can occur across the life span. In 1998, the Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine (IOM) and recently, in 2016, the European Food Safety Authority, recognized Ch as an essential nutrient and established dietary intake recommendations. Ch-deprivation can be seen in physiological conditions (e.g. intensive exercise, pregnancy, lactation) and pathological conditions (e.g. alcoholism and malnutrition) and has been associated with heart function impairment, insulin resistance, abnormal fat metabolism and renal failure. Myocardial dysfunction and renal failure also consist two major complications of diabetes mellitus. The term ‘’diabetic cardiomyopathy’’ has emerged to describe the presence of myocardial dysfunction in the absence of overt clinical coronary artery disease, valvular disease, and other conventional cardiovascular risk factors, such as hypertension and dyslipidaemia; the term diabetic nephropathy refers to chronic loss of kidney function in relation to damage of glomeruli.Population with diabetes is increasing at alarming rates worldwide and similarly, according to recent studies, the number of people prone to choline deficiency are also constantly increased. It is estimated that only 10% of the US-population is receiving adequate intake of Ch. Thus, through multiple pathophysiological mechanisms, the two events (Ch-deprivation and diabetes mellitus) could potentially coexist and interaffect myocardium and renal structural integrity and performanceThe aim of the study was to investigate the impact of dietary Ch-deprivation on cardiac and renal function in a streptozotocin (STZ)-experimentally induced diabetic setting in adult male Wistar rats.Material and Methods:Twenty-four 3-months-old adult male albino Wistar rats (body weight 298.6 ± 26.2g), were divided into four main groups (n=6 at each group), as follows: control, diabetic (DM), Ch-deprived (CD), and diabetic Ch-deprived (DM+CD). The induction of diabetes was performed by a single intraperitoneal injection of STZ (50 mg/kg of body weight with dilution in a 0.1 mol/L citrate solution, pH 4.5). The standard diet was enriched by choline (1.5 g/kg) at the expense of sucrose. The analytical composition (g/kg) of the CDD was: sugar 413, starch 110, dextrine 110, hydrogenated vegetable oil 100, pea protein 90, soya protein isolate 60, corn oil 50, mineral mix 35, vitamin mix 10, cellulose 10, vitamin free casein 10, L-cystine 2. Rat body weight was assessed weekly and animals were sacrificed after five weeks. Before euthanasia the animals underwent an echocardiography session and upon the animal sacrifice, blood was collected from the inferior vena cava and used for the estimation of the biochemical parameters (glucose, insulin, homocysteine, lipid profile, urea and creatinine). Hearts and kidneys were used for histological examination along with vascular endothelial growth factor (VEGF-A) and kidney injury molecule -1 (KIM -1) (kidneys only) immunohistochemistry. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.3. Effect of Dietary choline-deprivation on diabetic cardiomyopathyResults: Measurement of blood glucose levels revealed a successful induction of diabetes in the STZ-treated groups with concurrent hypoinsulinaemia. After five weeks of dietary intervention, at the echocardiographic assessment diabetic rats under choline deprivation exhibited an increased left ventricular (LV) wall tension index with a concomitant increased of LV velocity and a significant decreased LV posterior wall thickness as compared to diabetic rats fed standard diet. Furthermore, histopathology demonstrated an exacerbation of myocardial inflammation and fibrosis in the diabetic rat myocardium as a result of Ch-deprivation. VEGF immunohistochemistry expression was significantly upregulated in all groups compared to control.Discussion: In previous studies, our group reported the early deleterious effect of Ch-deprivation on the adult healthy rat myocardium. The dietary Ch-deprivation can exacerbate experimentally-induced diabetic cardiomyopathy in rats, within five weeks. The novel findings of this study demonstrate that choline deficient diabetic myocardium presents with a decreased left ventricular wall thickness and higher left ventricular wall tension index along with worsened cardiac inflammation and fibrosis as compared to the diabetic myocardium. The VEGF upregulated myocardial expression reflects the cardiac response to restore its impaired architecture and thus preserve its proper function. The herein presented findings are of particular importance since the examined experimental approach introduces a previously unknown comorbidity simulation of two metabolic disorders that seem to trigger the transition of a restrictive type of cardiomyopathy to a potential dilated type. Further investigation is required to determine the progress of this cardiomyopathy over time.Moreover, considering the major role of oxidative stress in the development of diabetes-induced complications, as well as previous findings of ours on the cardioprotective role of carnitine in attenuating Ch-deprivation induced cardiotoxicity, the herein presented experimental setting could be the beginning for the further exploring the role of Ch in preventing (or at least modifying) the progress of diabetic cardiomyopathy and the treatment strategies.Effect Dietary choline-deprivation effect on diabetic nephropathyResults: The Ch-deprived diabetic rats exhibited a significant deterioration in renal function with hyperthrophied kidneys (increased kidney weight index) associated with significant alterations in renal architecture characterized by significant increase in renal tubular necrosis, mesengial matrix expansion, and tubulo-interstitial fibrosis. Furthermore, a significant upregulation of the tubular injury marker (KIM-1) was found, while VEGF was significantly downregulated in this design.Discussion: Dietary Ch-deprivation developed renal lesion resembling to the one induced by ischemia-reperfusion model for renal damage The upregulation of renal KIM-1 (a crucial specific biomarker for diagnosis of early acute kidney injury both in humans and rodents) in choline deprived diabetic rats, in relation to increased blood urea and creatinine levels along with the histopathological findings, confirm the fact that the combined two insults act synergistically to impair renal function and to exacerbate structural damage. Since VEGF dysregulation is considered important factor in triggering the pathogenesis of diabetic nephropathy by inducing glomerulosclerosis and tubular atrophy and subsequent deterioration of renal function the VEGF downregulation in the kidneys of Ch-deprived and Ch-deprived diabetic rats reflects the detrimental effects of Ch deprivation in renal structure and function, It seems that Ch-deprivation acts as a co-factor which complicates the STZ-induced diabetic kidney pathology and the immunohistochemical findings of KIM-1 and VEGF are in line with the renal histopathological picture. This model, diabetes in a choline deprived setting, could probably simulate a clinical case resembling to the one seen in diabetic patients with advanced stage nephropathy. Clinical PerspectivesThe combined setting of Ch-deprivation and diabetes could eventually resemble common cases in clinical practice, including diabetic patients on parenteral nutrition and/or short bowel syndrome/ and/or autoimmune diseases, diabetic patients with chronic renal failure or hepatic failure and/or alcoholism and/or malnutrition, diabetes in pregnancy/lactating and post-menopausal women, but also critically ill patients.Diabetic cardiomyopathy and diabetic nephropathy are common serious complication of diabetes mellitus that might appear in the early disease stages and are associated with substantial morbidity and mortality. Taking into account the frequency of the potential inadequate dietary intake of Ch and its interaction with the progress of diabetic cardiomyopathy nephropathy, it turns out that dietary interventions could act as an adjunctive weapon to handle the cardiac dysfunction clinical entity without adding new side effects to the current pharmacological remedies.

Η χολίνη (Ch) είναι μια βασική θρεπτική ουσία που εμπλέκεται σε μια ευρεία ποικιλία μεταβολικών αντιδράσεων και λειτουργιών, τόσο στον άνθρωπο όσο και στα τρωκτικά. Εκτός του ότι αποτελεί συστατικό διαφόρων σημαντικών βιολογικών ενώσεων (συμπεριλαμβανομένων των μεμβανικών λεκιθινών, της σφιγγομυελίνης και του πλασμαλογόνου, της νευροδιαβιβαστικής ακετυλοχολίνης και του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων), η Ch εμπλέκεται σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες (π.χ. μεταβολισμός των ομάδων μεθυλίου, μεταφορά λιπιδίων, κλπ). Έτσι, η Ch είναι υψίστης σημασίας για τη βέλτιστη ανάπτυξη και λειτουργία πολλών οργάνων και βιολογικών συστημάτων, μεταξύ των οποίων το καρδιαγγειακό σύστημα και τα νεφρά. Το 1998, το Συμβούλιο Τροφίμων και Διατροφής του Ινστιτούτου Ιατρικής (IOM) και πρόσφατα, το 2016, η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων αναγνώρισε την Ch ως βασικό θρεπτικό συστατικό και καθιέρωσαν συστάσεις για την πρόσληψη τροφής. Η έλλειψη Ch μπορεί να παρατηρηθεί σε φυσιολογικές συνθήκες (π.χ. εντατική άσκηση, εγκυμοσύνη, γαλουχία) και παθολογικές καταστάσεις (π.χ. αλκοολισμός και υποσιτισμός) και έχει συσχετιστεί με εξασθένηση της καρδιακής λειτουργίας, αντίσταση στην ινσουλίνη, μη φυσιολογικό μεταβολισμό του λίπους και νεφρική ανεπάρκεια. Η δυσλειτουργία του μυοκαρδίου και η νεφρική ανεπάρκεια αποτελούν επίσης δύο κύριες επιπλοκές του σακχαρώδους διαβήτη. Ο όρος «διαβητική μυοκαρδιοπάθεια» εμφανίστηκε για να περιγράψει την παρουσία δυσλειτουργίας του μυοκαρδίου απουσία εμφανούς κλινικής στεφανιαίας νόσου, βαλβιδικής νόσου και άλλων παραγόντων καρδιαγγειακού κινδύνου, όπως υπέρταση και δυσλιπιδαιμία και ο όρος «διαβητική νεφροπάθεια» αναφέρεται στη χρόνια απώλεια νεφρικής λειτουργίας σε σχέση με τη βλάβη του σπειράματος.Ο πληθυσμός με σακχαρώδη διαβήτη αυξάνεται με ανησυχητικούς ρυθμούς σε παγκόσμιο επίπεδο και παρόμοια, σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, αυξάνεται συνεχώς και ο αριθμός των ανθρώπων που είναι επιρρεπείς σε ανεπάρκεια χολίνης. Εκτιμάται ότι μόνο το 10% του πληθυσμού των ΗΠΑ λαμβάνει επαρκή πρόσληψη Ch. Έτσι, μέσω πολλαπλών παθοφυσιολογικών μηχανισμών, τα δύο συμβάματα (στέρηση Ch και σακχαρώδης διαβήτης) θα μπορούσαν ενδεχομένως να συνυπάρχουν και να αλληλεπιδρούν με τη δομική ακεραιότητα και απόδοση του μυοκαρδίου και της νεφρικής δομής.Σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο αντίκτυπος της διατροφικής στέρησης του Ch στην καρδιακή και νεφρική δομή και λειτουργία σε στρεπτοζοτοκίνη (STZ)-πειραματικά προκαλούμενο σακχαρώδη διαβητη ρύθμιση σε ενήλικους αρσενικούς αρουραίους Wistar.Υλικό και μέθοδοι: Εικοσιτέσσερεις ηλικίας αρσενικοί αρουραίοι Wistar albino 3 μηνών (σωματικό βάρος 298,6±26,2 g), διαιρέθηκαν σε τέσσεερις ομάδες (Ν=6 σε κάθε ομάδα) ως εξής: Ομάδες μαρτύρων (C) και διαβητικών (DM), υπό αγωγή με πρότυπη δίαιτα, ομάδα υπό αγωγή με δίαιτα ελλειπή σε χολίνη (CD), και ομάδα διαβητικών υπό δίαιτα ελλειπή σε χολίνη (DM+CD). Η επαγωγή του διαβήτη διεξήχθη με μία απλή ενδοπεριτοναϊκή ένεση STZ (50 mg/kg σωματικού βάρους). Μετά από πέντε εβδομάδες με νάρκωση τα ζώα υποβλήθηκαν σε ηχοκαρδιογραφικό έλεγχο και μετά την ευθανασία συλλέχθηκε αίμα από την κατωρη φλεβα και χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των βιοχημικών παραμέτρων (γλυκόζη, ινσουλίνη, ομοκυστεΐνη, λιπίδια, ουρία και κρεατινίνη). H καρδι;a και oi νεφρά χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική εξέταση ενώ έγινε και ανοσοϊστοχημική εκτίμηση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF-A) και του μορίου νεφρικής βλάβης -1 (ΚΙΜ-1) (μόνο στα νεφρά).Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του GraphPad Prism 5.3. Επίδραση της στέρησης της τροφής από τη χολίνη στην διαβητική καρδιομυοπάθειαΑποτελέσματα: Η μέτρηση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα αποκάλυψε μια επιτυχή πρόκληση διαβήτη στις ομάδες που έλαβαν STZ με ταυτόχρονη υποινσουλιναιμία. Μετά από πέντε εβδομάδες διαιτητικής παρέμβασης, στην ηχοκαρδιογραφική εκτίμηση οι διαβητικοί επίμυες υπό στέρηση χολίνηs (DM+CD) παρουσίασαν αυξημένο δείκτη τάσης αριστερής κοιλίας (LV) με συνακόλουθη αύξηση της LV ταχύτητας και σημαντικά μειωμένο πάχος οπίσθιου τοιχώματος LV σε σύγκριση με διαβητικούς αρουραίους που τρέφονται με πρότυπη δίαιτα. Επιπλέον, η ιστοπαθολογία εκτίμηση έδειξε επιδείνωση της φλεγμονής και της ίνωσης στο διαβητικό μυοκάρδιο ως αποτέλεσμα της στέρησης Ch. Η έκφραση του VEGF αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα έλεγχου.Συζήτηση: Σε προηγούμενες μελέτες η ομάδα μας ανέφερε την πρώιμη τοξική επίδραση της στέρησης της Ch στο μυοκάρδιο υγιών ενηλίκων επιμύων. Η διατροφική στέρηση Ch μπορεί να επιδεινώσει την πειραματικά προκαλούμενη διαβητική μυοκαρδιοπάθεια σε επίμυες, εντός πέντε εβδομάδων. Τα νέα ευρήματα αυτής της μελέτης καταδεικνύουν ότι το διαβητικό μυοκάρδιο υπό έλλειψη χολίνης παρουσιάζει μειωμένο πάχος τοιχώματος της αριστερής κοιλίας και υψηλότερο δείκτη τάσης αριστερού κοιλιακού τοιχώματος μαζί με επιδεινούμενη καρδιακή φλεγμονή και ίνωση σε σύγκριση με το διαβητικό μυοκάρδιο. Η αυξημένη έκφραση VEGF στο μυοκάρδιο αντανακλά την καρδιακή απόκριση για να αποκαταστήσει την μειωμένη αρχιτεκτονική της και έτσι να διατηρήσει τη σωστή λειτουργία της. Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ είναι ιδιαίτερα σημαντικά αφού η εξεταζόμενη πειραματική προσέγγιση εισάγει μια προηγουμένως άγνωστη προσομοίωση συννοσηρότητας δύο μεταβολικών διαταραχών που φαίνεται να πυροδοτούν τη μετάβαση ενός τύπου περιοριστικής μυοκαρδιοπάθειας σε ένα τύπο δυνητικά διατατικής μυοκαρδιοπάθειας. Λαμβάνοντας υπόψη τον μείζονα ρόλο του οξειδωτικού στρες στην ανάπτυξη επιπλοκών που προκαλούνται από τον διαβήτη, καθώς και τα προηγούμενα μας ευρήματα σχετικά με τον καρδιοπροστατευτικό ρόλο της καρνιτίνης στην εξασθένηση της καρδιοτοξικότητας που προκαλείται από τη στέρηση Ch, η παρούσα πειραματική ρύθμιση θα μπορούσε να αποτελεί την αρχή για περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της Ch στην πρόληψη (ή τουλάχιστον στην τροποποίηση) της εξέλιξης της διαβητικής μυοκαρδιοπάθειας και της θεραπευτικής στρατηγικής.Διαιτητική επίδραση στέρησης της χολίνης στη διαβητική νεφροπάθειαΑποτελέσματα: Οι διαβητικοί επίμυες που είχαν υποστεί στέρηση Ch παρουσίασαν σημαντική επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας με υπερτροφικούς νεφρούς (αυξημένος δείκτης βάρους νεφρού) που σχετίζετονταν με σημαντικές αλλοιώσεις στη νεφρική δομή χαρακτηριζόμενη από σημαντική αύξηση της νεφρικής σωληνωριακής νέκρωσης και ίνωσης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ΚΙΜ-1 σε όλες τις ομάδες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ενώ ο VEGF βρέθηκε μειωμένος στο υπό μελέτη μοντέλο.Συζήτηση: Η αύξηση του KIM-1, ενός κρίσιμου βιοδείκτη για τη διάγνωση πρώιμης οξείας νεφρικής βλάβης τόσο σε ανθρώπους όσο και σε τρωκτικά, στους διαβητικούς επίμυες υπό διαιτητική στέρηση χολίνης , σε σχέση με τα αυξημένα επίπεδα ουρίας και κρεατινίνης στο αίμα μαζί με τα ιστοπαθολογικά ευρήματα, επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι οι συνδυασμός των δύο παθολογικών παραγόντων δρά συνεργικά με αποτέλεσμα την έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας και την επιδείνωση των δομικων βλαβών. Δεδομένου ότι η δυσλειτουργία του VEGF θεωρείται σημαντικός παράγοντας στην ενεργοποίηση της παθογένεσης της διαβητικής νεφροπάθειας προκαλώντας σπειραματοσκλήρυνση και σωληναριακή ατροφία και επακόλουθη μείωση της νεφρικής λειτουργίας, η μείωση του VEGF στους νεφρούς των διαβητικών επιμύων υπο διαιτητική στέρηση Ch, αντανακλά τις επιβλαβείς επιδράσεις της έλλειψης Ch σε νεφρική δομή και λειτουργία. Φαίνεται ότι η στέρηση Ch δρα ως συν-παράγοντας που περιπλέκει την παθολογία των διαβητικών νεφρών που προκαλείται από STZ και τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα των KIM-1 και VEGF είναι σύμφωνα με την νεφρική ιστοπαθολογική εικόνα. Αυτό το μοντέλο, δηλ θα μπορούσε πιθανώς να προσομοιάσει μια κλινική περίπτωση που που παρατηρείται σε διαβητικούς ασθενείς με νεφροπάθεια σε προχωρημένο στάδιο.Κλινικές προοπτικέςΟ συνδυασμός σακχαρώδη διαβήτη και διατητικής έλλειψης χολίνης, θα μπορούσε τελικά να μοιάζει με κοινές περιπτώσεις στην κλινική πρακτική, συμπεριλαμβανομένων διαβητικών ασθενών υπό παρεντερική διατροφή και/ ή σύνδρομο βραχέως εντέρου και/ ή αυτοάνοσων ασθενειών και/η νεφρική ανεπάρκεια ή ηπατική ανεπάρκεια ή / και αλκοολισμό και / ή υποσιτισμό, ή διαβήτη σε εγκυμοσύνη / θηλασμός και μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, κλπ.Η διαβητική μυοκαρδιοπάθεια και η διαβητική νεφροπάθεια είναι συνήθης σοβαρή επιπλοκή του σακχαρώδους διαβήτη που μπορεί να εμφανιστεί στα αρχικά στάδια της νόσου και σχετίζεται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Λαμβάνοντας υπόψη τη συχνότητα της δυνητικής ανεπαρκούς διαιτητικής πρόσληψης της Ch και της αλληλεπίδρασής της με την εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας και μυοκαρδιοπάθειας, αποδεικνύεται ότι οι διαιτητικές παρεμβάσεις θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως συμπληρωματικό όπλο για την αντιμετώπιση της καρδιακής και νεφρικής δυσλειτουργίας χωρίς προσθήκη νέων παρενεργειών απο φάρμακα.