Η δράση του υαλουρονικού, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, σε καρκινικά κύτταρα μαστού με διαφοροποιημένη έκφραση οιστρογονοϋποδοχέων

Abstract

Breast cancer is a heterogeneous and complicated disease. The estrogen receptors (ERs), that are used to categorize the types of the disease and the extracellular matrix (ECM) biomolecules, whose expression patterns are modulated during the disease, play pivotal role during its progression. Hyaluronan (HA) is one of the major ECM macromolecules. Its high expression levels have been correlated with poor prognosis and malignant phenotype in various cancer types, including breast cancer. Depending on its molecular size, HA exhibits different physicochemical and biological properties and it is able to regulate the cellular responses and behavior in a different mode. In breast cancer, HA of different molecular sizes promotes or attenuates signaling pathways that control cancer progression. During the first stage of the present doctoral thesis, HA of different molecular sizes was isolated. Three of them (<10, 30 and 200 kDa) were evaluated on their effects on breast cancer cells of different ER status. For this purpose, low metastatic, ERα+ cells breast cancer cells (MCF-7) and highly metastatic ERα-/β+ breast cancer cells (MDA-MB-231) were used. This study demonstrates by using scanning electron microscopy (SEM) that the HA affects cellular morphology. In particular, 200 kDa ΗΑ promotes an epithelial- like phenotype. This observation is supported by modulations on the expression patterns of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) markers, of the mesenchymal type MDA-MB-231 cells. Reduction of the expression levels of the mesenchymal markers snail2/slug, fibronectin and vimentin was observed. On the contrary, the expression levels of the epithelial marker E-cadherin were increased. Furthermore, the expression levels of important molecules, such as CD44 (HA receptor), HA synthase 2 (HAS2) and several metalloproteinases (MMPs), that are correlated with cellular aggressiveness and invasiveness, were reduced. The modulations above led to modulations of the cellular functional properties, reducing breast cancer cells’ proliferation and invasion. This effect possibly occurs partly due to the competition between the exogenously added HA fragments with the endogenous HA, to bind to CD44 as well as to attenuate the activation of proteins such as ERK1/2 and Akt. These proteins constitute key regulators of cellular behavior. Moreover, the molecular sizes of HA that were studied, reduced cellular migration by increasing cellular adhesion, and the expression levels of syndecan 4.The transfected cells shERβ MDA-MB-231, which have been developed in the lab, express significantly lower levels of ERβ. As a result, they are characterized by reduced aggressiveness in comparison to MDA-MB-231 cells and their morphology as well as the expression patterns of several key molecules have been changed. The present study demonstrates that HA is able to trigger phenotypical changes and regulate the behavior of these cells. In particular, 200 kDa HA reduces the proliferation and the invasive capacity of the shERβ MDA-MB-231 cells. Moreover, 200 kDa HA modulates the expression profile of key regulators of the cellular behavior, such as CD44, HAS2 and MMP7. In addition, it promotes the epithelial phenotype of these cells, upregulating the expression levels of E-cadherin and downregulating the expression levels of the mesenchymal marker snail2/slug. However, changes of the migratory capacity of the cells after the HA treatment were not observed, underlining the importance of ER status on breast cancer cells’ responses and behavior. In conclusion, the data of the present doctoral thesis clearly demonstrate that the HA effects on breast cancer cells depend on its molecular size as well as the ER status of the cells. Furthermore, they indicate the anti-cancer properties of 200 kDa HA in the breast cancer cell lines that were studied. Therefore, 200 kDa HA could be a useful tool in the development of therapeutic strategies against aggressive types of breast cancer.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί μια ετερογενή και πολύπλοκη ασθένεια. Κατά την εξέλιξή του, κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζουν οι οιστρογονοϋποδοχείς (ERs), με βάση τους οποίους κατηγοριοποιείται η νόσος, καθώς και διάφορα βιομόρια του εξωκυττάριου χώρου (ECM), των οποίων τα επίπεδα έκφρασης μεταβάλλονται κατά την ασθένεια. Ένα από τα μόρια αυτά είναι το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ). Υψηλά επίπεδα έκφρασης του ΗΑ έχουν συσχετιστεί με κακή πρόγνωση και επιθετικές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού. Το ΗΑ ανάλογα με το μοριακό του μέγεθος διαθέτει διαφορετικές φυσικοχημικές και βιολογικές ιδιότητες και ρυθμίζει με διαφορετικό τρόπο τις κυτταρικές αποκρίσεις και συμπεριφορές. Στον καρκίνο του μαστού, μόρια ΗΑ διαφορετικού μοριακού μεγέθους μπορούν είτε να προωθούν είτε να αναστέλλουν σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν την εξέλιξη της νόσου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο πρώτο στάδιο η απομόνωση μορίων ΗΑ με διαφορετικά μοριακά μεγέθη. Τρία από αυτά (<10, 30 και 200 kDa) αξιολογήθηκαν ως προς τη βιολογική τους επίδραση σε καρκινικά κύτταρα μαστού με διαφορετικό προφίλ έκφρασης ER. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν καρκινικά κύτταρα μαστού χαμηλής μεταστατικότητας, ERα+ (MCF-7) και υψηλής μεταστατικότητας, ERα-/β+ (MDA-MB-231). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποδεικνύει μετά από λεπτομερείς μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (SEM) την επίδραση που έχει το ΗΑ στην κυτταρική μορφολογία. Ειδικότερα, ΗΑ μεγέθους 200 kDa προωθεί έναν επιθηλιακού τύπου φαινότυπο. Το παραπάνω συμπέρασμα ενισχύεται από αλλαγές στο προφίλ έκφρασης δεικτών μετασχηματισμού από επιθηλιακό φαινότυπο σε μεσεγχυματικό (ΕΜΤ), στα μεσεγχυματικής μορφολογίας κύτταρα MDA-MB-231. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων των μεσεγχυματικών δεικτών snail2/slug, fibronectin και vimentin. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του επιθηλιακού δείκτη E-cadherin αυξήθηκαν. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης σημαντικών μορίων που συνδέονται με την επιθετική συμπεριφορά των κυττάρων αυτών, όπως του CD44 (υποδοχέας του HA), της HA συνθάσης 2 (HAS2) και ποικίλων μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), που σχετίζονται με την κυτταρική διήθηση. Τα παραπάνω οδήγησαν σε μεταβολές στις λειτουργικές ιδιότητες και των δύο υπό μελέτη κυτταρικών σειρών, μειώνοντας την ικανότητα πολλαπλασιασμού και διήθησης των καρκινικών κυττάρων. Αυτό πιθανόν οφείλεται εν μέρει στον ανταγωνισμό των μορίων ΗΑ με το ενδογενές ΗΑ για πρόσδεση στο CD44, καθώς και στην αναστολή της ενεργοποίησης σημαντικών πρωτεϊνών, όπως των ERK1/2 και Akt, που αποτελούν μόρια-κλειδιά στη ρύθμιση της κυτταρικής συμπεριφοράς. Επιπλέον, τα τρία μοριακά μεγέθη ΗΑ που μελετήθηκαν μείωσαν τη μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων, αυξάνοντας την κυτταρική προσκόλληση, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης της συνδεκάνης 4 σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο.Τα τροποποιημένα κύτταρα shERβ MDA-MB-231, τα οποία έχουν δημιουργηθεί και αναπτυχθεί στο εργαστήριο και στα οποία έχει κατασταλεί σε σημαντικό βαθμό η έκφραση του ERβ, παρουσιάζουν μειωμένη επιθετικότητα σε σύγκριση με τα MDA-MB-231 κύτταρα, μορφολογικές μεταβολές, καθώς και αλλαγές στο προφίλ έκφρασης ποικίλων μορίων δεικτών. Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι το ΗΑ μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στο φαινότυπο και τη συμπεριφορά των καρκινικών αυτών κυττάρων. Συγκεκριμένα, ΗΑ μεγέθους 200 kDa μειώνει τον πολλαπλασιασμό και την ικανότητα διήθησης των κυττάρων αυτών. Επιπρόσθετα, μεταβάλλει το προφίλ έκφρασης μορίων-ρυθμιστών της κυτταρικής συμπεριφοράς, όπως των CD44, HAS2 και MMP7. Επιπλέον, προωθεί τον επιθηλιακού τύπου φαινότυπο των κυττάρων αυτών αυξάνοντας τα επίπεδα έκφρασης της E-cadherin και μειώνοντας τα επίπεδα του μεσεγχυματικού δείκτη snail2/slug. Παρόλα αυτά, στην συγκεκριμένη κυτταρική σειρά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα κυτταρικής μετανάστευσης, υποδεικνύοντας τη σημασία του προφίλ έκφρασης των ER στη συμπεριφορά και τις αποκρίσεις των καρκινικών κυττάρων μαστού.Συμπερασματικά, τα δεδομένα της παρούσας μελέτης δηλώνουν ξεκάθαρα ότι οι επιδράσεις του ΗΑ σε καρκινικά κύτταρα μαστού εξαρτώνται τόσο από το μοριακό μέγεθος του ΗΑ όσο και από το προφίλ έκφρασης ER των κυττάρων. Επιπλέον, υποδεικνύουν τις αντί-καρκινικές ιδιότητες του 200 kDa HA και στις τρεις περιπτώσεις που μελετήθηκαν. Επομένως, ΗΑ με μοριακό μέγεθος 200 kDa θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο στην ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι επιθετικών μορφών καρκίνου του μαστού.