Ανάλυση της λειτουργικής συμμετοχής σηματοδοτικών μονοπατιών αντιοξειδωτικής απόκρισης στη γήρανση και την καρκινογένεση

Abstract

The integrity of proteome homeodynamics (proteostasis) is critical for cell homeostasis and survival and is carried out by a highly integrated modular system, i.e. the proteostasis network. Key components of the proteostasis network are the molecular chaperones, the ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome degradation pathways, as well as the NRF2/KEAP1 signaling pathway, which mobilizes cellular responses to oxidative and/or electrophilic stress. Deregulation of proteostasis leads to proteome instability and proteotoxic stress, and is considered as one of the hallmarks of aging. Furthermore, it was recently proposed that proteome instability likely constitutes a hallmark of cancer. The aim of this Ph.D. thesis was the systematic study of the functional involvement of antioxidant responses signaling pathways in aging and carcinogenesis. As these signaling pathways regulate (among others) the proteostasis network, we also studied the functional alterations of proteostasis network during cellular senescence, the effect of bioactive molecules in antioxidant and proteostatic modules on the observed cellular phenotype, as well as the functional involvement of antioxidant responses and proteome instability in carcinogenesis. Following an extensive high-throughput screening of bioactive molecules against cellular senescence, our study was focused on the peptide Hexapeptide-11, which was originally isolated from yeast extracts and was later synthesized by solid state synthesis to high purity. We also studied the hemi-synthetic derivative of indirubins, 6-bromoindirubin-3’-oxime (6BIO) which is found in plants and edible gastropod mollusks and has been described as a potent inhibitor of Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). Our findings support that both molecules are positive modulators of antioxidant responses and of the proteostasis network modules in normal human fibroblasts. Furthermore, we observed that Hexapeptide-11 conferred significant protection in fibroblasts against oxidative stress-induced premature cellular senescence, and could thus represent a promising anti-ageing agent. Regarding 6BIO, it was found to reduce the oxidative load and increase resistance to stress. In addition, although long-term incubation of fibroblasts with 6BIO reduces their replicative potential, it decreases the levels of cellular senescence-mediated oxidative and proteotoxic stress; therefore, 6BIO could also likely exert anti-tumor properties. Next, in order to study whether proteome instability is involved in carcinogenesis, we used the genetically modified cellular models of stepwise carcinogenesis derived from fibroblasts and epithelial cells. In these models, normal cells were transformed by introducing the hTERT gene (stabilization of telomeres length), the SV40 large-T (LT) oncogene (inactivation of p53 and pRB tumor suppressor proteins) and the oncogenic allele of the HRAS gene, HRASV12. Furthermore, we studied gene expression levels of proteostatic modules in biopsies obtained from breast and colon tumors. Our findings in the cellular models of genetic stepwise carcinogenesis uncovered significant alterations in the antioxidant responses and proteostasis network modules, regarding both their differential expression as well as the accumulation of proteome instability during the progression of carcinogenesis. Furthermore, during the study of proteostatic genes in biopsies of breast and colon cancer, we observed a profound downregulation of CLU and HSPB3 genes expression in the majority of malignant colorectal tumors. Similarly, the HSPB2 molecular chaperone gene was downregulated in breast tumors compared to their normal adjacent tissue. These novel findings indicate that proteome instability likely consists an important major and early hallmark in cancer progression.

Η διατήρηση της ομοιοδυναμικής ισορροπίας του πρωτεώματος (πρωτεόσταση) είναι απαραίτητη για την κυτταρική ομοιοστασία και την επιβίωση του οργανισμού και επιτελείται από ένα σύνθετο δίκτυο παραγόντων, που ονομάζεται δίκτυο πρωτεόστασης. Βασικά συστατικά του δικτύου πρωτεόστασης είναι οι μοριακές συνοδοί, τα πρωτεολυτικά μονοπάτια ουβικιτίνης-πρωτεασώματος και αυτοφαγίας-λυσοσώματος καθώς και το σηματοδοτικό μονοπάτι NRF2/KEAP1, που είναι υπεύθυνο για την απόκριση των κυττάρων σε οξειδωτικό και/ή ηλεκτρόφιλο στρες. Η διατάραξη της πρωτεόστασης οδηγεί σε πρωτεωμική αστάθεια και πρωτεοτοξικό στρες και αποτελεί ορόσημο της γήρανσης. Επιπλέον, πρόσφατα προτάθηκε ότι η απορρύθμιση της πρωτεόστασης πιθανόν συνιστά και ορόσημο του καρκίνου. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής υπήρξε η συστηματική μελέτη της λειτουργικής συμμετοχής σηματοδοτικών μονοπατιών αντιοξειδωτικής απόκρισης στη γήρανση και την καρκινογένεση. Καθώς τα σηματοδοτικά αυτά μονοπάτια ρυθμίζουν (μεταξύ άλλων) και το δίκτυο πρωτεόστασης, μελετήθηκαν επίσης οι λειτουργικές μεταβολές του δικτύου πρωτεόστασης κατά την κυτταρική γήρανση, η επίδραση βιοδραστικών μορίων σε αντιοξειδωτικά ρυθμιστικά μονοπάτια και/ή στο δίκτυο πρωτεόστασης στον παρατηρηθέντα κυτταρικό φαινότυπο, καθώς και η λειτουργική εμπλοκή της πρωτεωμικής αστάθειας στην καρκινογένεση. Σε συνέχεια μίας εκτενούς μελέτης σάρωσης υψηλής απόδοσης βιοδραστικών μορίων έναντι της κυτταρικής γήρανσης, στην παρούσα Διατριβή εστιάσαμε τη μελέτη μας στο πεπτίδιο Hexapeptide-11, που αρχικά απομονώθηκε από εκχυλίσματα σακχαρομύκητα και αργότερα συντέθηκε με σύνθεση στερεάς φάσης σε υψηλή καθαρότητα καθώς και στο ημι-συνθετικό παράγωγο των ιντιρουμπινών, 6-bromoindirubin-3’-oxime (6BIO), το οποίο εντοπίζεται σε χρωστικές παραγόμενες κυρίως από φυτά και βρώσιμα γαστερόποδα μαλάκια και θεωρείται ένας ειδικός αναστολέας της κινάσης της συνθετάσης του γλυκογόνου 3β (GSK3β). Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι και τα δύο μόρια αποτελούν σημαντικούς θετικούς ρυθμιστές του δικτύου πρωτεόστασης και της αντιοξειδωτικής απόκρισης σε ανθρώπινους φυσιολογικούς ινοβλάστες. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι το Hexapeptide-11 παρέχει σημαντική προστασία σε ινοβλάστες έναντι της πρώιμα επαγόμενης κυτταρικής γήρανσης λόγω οξειδωτικού στρες και ενδεχομένως θα μπορούσε να εμφανίζει αντι-γηραντικές ιδιότητες. Όσον αφορά στο 6BΙΟ, βρέθηκε ότι μειώνει το ενδοκυτταρικό οξειδωτικό φορτίο και αυξάνει την ανθεκτικότητα των κυττάρων σε στρεσογόνους παράγοντες. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε ότι η παρατεταμένη χορήγηση του 6BIO, παρόλο που προκαλεί ελάττωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων, μειώνει τα σχετιζόμενα με την κυτταρική γήρανση επίπεδα οξειδωτικού και πρωτεοτοξικού στρες και συνεπώς, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα μόριο με αντι-καρκινική δράση. Στη συνέχεια, προκειμένου να μελετήσουμε εάν η πρωτεωμική αστάθεια εμπλέκεται στις διάφορες φάσεις της καρκινογένεσης, χρησιμοποιήθηκαν τα κυτταρικά μοντέλα σταδιακής γενετικής καρκινογένεσης ινοβλαστών και επιθηλιακών κυττάρων. Τα μοντέλα αυτά αφορούν στη σταδιακή επιμόλυνση των φυσιολογικών κυττάρων με το γονίδιο hTERT (σταθεροποίηση του μήκους των τελομερών), το ογκογονίδιο SV40 large-T (LT) (απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών p53 και pRB), καθώς και το ογκογόνο αλληλόμορφο του HRAS γονιδίου, το HRASV12. Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων του δικτύου πρωτεόστασης σε βιοψίες ασθενών με καρκίνο μαστού και παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας στα υπό μελέτη κυτταρικά μοντέλα έδειξαν σημαντικές μεταβολές στο δίκτυο πρωτεόστασης, όσον αφορά τόσο στη διαφορική έκφραση των βασικών συστατικών του όσο και στη συσσώρευση πρωτεωμικής αστάθειας κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης. Επιπρόσθετα, η μελέτη των γονιδίων πρωτεόστασης σε βιοψίες ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου κατέδειξε σημαντική μειορρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των μοριακών συνοδών CLU και HSPB3 στην πλειοψηφία των κακοήθων όγκων. Παράλληλα, σε βιοψίες ασθενών με καρκίνο μαστού παρατηρήθηκε σημαντική μειορρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της μοριακής συνοδού HSPB2 σε σχέση με τον φυσιολογικό παρακείμενο ιστό. Τα ευρήματα αυτά δεικνύουν ότι η πρωτεωμική αστάθεια πιθανόν αποτελεί σημαντικό πρώιμο ορόσημο εξέλιξης της καρκινογένεσης.