Συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση θαλάσσιων βακτηριοφάγων

Abstract

Isolation and/or full characterization, including sequencing and annotations, was per-formed for five double stranded DNA bacteriophages of the Myoviridae and Si-phoviridae families, named φGrn1, φSt2, Aphrodite1, Athena1 and Ares1, considered to be of great interest for phage therapy against Vibrios. Phylogenetic analysis re-vealed that φGrn1 and φSt2 belong to the “schizoT4like” clade, Aphrodite1 to “phiKZlikevirus” clade, Athena1 to an unclassified clade of Myoviridae family and Ares1 to an unclassified clade of Siphoviridae family. In addition, phage–host meta-bolic interactions and exploitation was studied by transcript profiling of selected viral and host genes. Although many reports of newly sequenced viruses have provided a large set of information, basic research related to the shift of the bacterial metabolism during infection remains stagnant. The function of many viral protein products in the process of infection is still unknown. Regarding the two “schizoT4like” phages ge-nome annotation identified the presence of several viral open reading frames (ORFs) participating in metabolism, including a Sir2/cobB (sirtuin) protein and a number of genes involved in auxiliary NAD+ and nucleotide biosynthesis, necessary for phage DNA replication. Key genes were subsequently selected for detail study of their ex-pression levels during infection. Additionally comparative genomic analysis with other Vibrio phages was also performed to establish the presence and location of homing endonucleases, tRNAs and lysozymes, highlighting distinct features for them. This work suggests a complex metabolic interaction and exploitation of the host metabolic pathways and biochemical processes, including a possible post-translational protein modification, by “schizoT4like” viruses during infection. Distinctive features of the other 3 viruses are also studied and discussed. Phage therapy interest has been revived during the last decade in an attempt to tackle antibiotic resistant bacteria, but its appli-cation is hampered by the development of phage-resistant bacterial strains. Although bacterial intracellular molecular mechanisms of resistance development against phage infections have been well characterized over the years, the knowledge about defensive mechanisms that include alterations in membrane proteins remains inadequate. Bacte-ria can develop resistance against phages not only through costly constitutive muta-tions, but also by altering, shutting down or diminishing the expression of specific transmembrane channels. Transcriptional changes of membrane and transmembrane transporters of the Gram negative fish pathogen Vibrio alginolyticus were monitored on phage-resistant strains against 3 of the lytic Vibrio phages isolated and/or character-ized in the current thesis, belonging to “schizoT4like” and “phiKZlikevirus” clades of Myoviridae family and a lytic bacteriophage belonging to Siphoviridae family. Phage-resistant strains of V. alginolyticus revealed also phenotypic differences on growth rate and metabolic activity compared to the wild type strain. We correlated these differ-ences with changes in the transcription levels of sugar and amino acid ABC, PTS and other transporters. More specifically, the targeted transporters were downregulated, whereas some transcript levels were almost totally depleted. Changes of intracellular metabolites in the resistant strains were also monitored. Finally, we studied the tran-scriptional pattern of the biochemical pathways of TCA cycle and amino acid biosyn-thesis. Several defense mechanisms that bacteria may utilize in order to circumvent viral attack, have been reported in the literature, yet the mechanisms that regulate the metabolic reprogramming of phage-resistant strains remain rather unexplored. These results suggest that phage resistant bacteria are able to diminish the transcription levels of the membrane transporters and reprogram their metabolism. The present work pro-motes Vibrio sp. for studying the mechanisms that Gram negative bacteria may follow against their viral predators, emphasizing that phage resistant phenotype in Vibrio spe-cies can be a result of a metabolic adaptation and reproramming, while also strength-ens the concept for developing phage cocktails against resistant to antibiotics bacteria.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και/ή πλήρης χαρακτηρισμός, συμπεριλαμβανομένου του γονιδιωμάτος και των γονιδίων τους, για πέντε λυτικούς βακτηριοφάγους των οικογενειών Myoviridae και Siphoviridae, όπου ονομάστηκαν φGrn1, φSt2, Aphrodite1, Athena1 and Ares1 και θεωρούνται καλοί υ-ποψήφιοι για εφαρμογή φαγοθεραπείας στις υδατοκαλλιέργειες απέναντι στα παθογό-να των ψαριών του γένους Vibrio. H φυλογενετική ανάλυση και η συγκριτική γονιδιωματική έδειξε ότι οι φGrn1 και φSt2 ανήκουν στον κλάδο “schizoT4like”, o Aphrodite1 στον κλάδο “phiKZlikevirus”, o Athena1 σε μη καταταγμένους σε κλά-δους φάγους της οικογένειας Myoviridae και ο Ares1 σε μη καταταγμένους σε κλά-δους φάγους της οικογένειας Siphoviridae. Μετά την αλληλούχιση των φGrn1 και φSt2, πραγματοποιήθηκε λειτουργική γονιδιωματική με ανάλυση των μεταγραφημά-των του ιού και του βακτηρίου, ώστε να μελετηθούν τα γονίδια που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση των δύο την ώρα της μόλυνσης. Αν και οι αναφορές με νεοαλληλου-χημένα γονιδιώματα έχουν προσφέρει μεγάλο και χρήσιμο όγκο πληροφορίας τα τε-λευταία χρόνια, η βασική έρευνα σχετιζόμενη με τον μεταβολικό χειρισμό που βιώνει ο ξενιστής από τον ιό την ώρα της μόλυνσης από τους “schizoT4like” φάγους απου-σιάζει. Η λειτουργία πολλών ανοιχτών αναγνωστικών πλαισίων των βακτηριοφαγικών γονιδιωμάτων παραμένει άγνωστη. Όμως, η in silico πρόβλεψη γονιδίων αποκάλυψε πολλά από αυτά που σχετίζονται με την βιοσύνθεση του NAD+, μία πρωτεΐνη με δρά-ση σιρτουίνης (Sir2/cobB πρωτεΐνη), αλλά και γονιδίων που συμμετέχουν στην βιο-σύνθεση νουκλεοτιδίων, απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό του φαγικού DNA. Αυτά τα γονίδια κλειδιά μελετήθηκαν περαιτέρω μέσω μεταγραφομικής ανάλυσης κα-τά τη διάρκεια της μόλυνσης. Ακόμα, η συγκριτική γονιδιωματική χρησιμοποιήθηκε για να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν μεταθετές ενδονουκλεάσες που φέρουν τα φαγικά γονιδιώματα, μαζί με τα tRNAs και τις φαγικές λυσοζύμες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνει μία πολύπλοκη μεταβολική αλληλεπίδραση του δυαδικού συστήματος Vibrio-λυτικός φάγος, αλλά και έναν μεταβολικό χειρισμό που υπόκειται ο ξενιστής από τον ιό συμπεριλαμβανομένης μίας μεταμεταφραστικής πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης με στόχο την ενεργοποίηση πολλών ενζύμων. Μοναδικά και ενδια-φέροντα στοιχεία των άλλων τριών βακτηριοφάγων επίσης αναλύονται και συζητιού-νται. Ο βιολογικός έλεγχος παθογόνων βακτηρίων με βακτηριοφάγους, ή αλλιώς φαγοθεραπεία, έχει επανέλθει στο προσκήνιο τα τελευταία χρόνια σε μια προσπάθεια να αντιμετωπιστούν τα βακτήρια που είναι ανθεκτικά στα αντιβιοτικά. Παρόλα αυτά όμως η εφαρμογή καθυστερεί, με έναν από τους λόγους να είναι η ανθεκτικότητα που εμφανίζουν τα βακτήρια στους ιούς. Αν και πολλοί μοριακοί ενδοκυτταρικοί μηχανι-σμοί έχουνε περιγραφεί και μελετηθεί τα τελευταία χρόνια και ευθύνονται για την αν-θεκτικότητα, η έρευνα γύρω από μηχανισμούς άμυνας που συμπεριλαμβάνουν την αναδιάταξη των πρωτεϊνών-καναλιών της κυτταρικής μεμβράνης των ανθεκτικών στελεχών παραμένει ανεπαρκής. Τα βακτήρια μπορούν να αναπτύξουν ανθεκτικότητα σε λυτικούς φάγους, όχι μόνο μέσα από ενεργειακά δαπανηρές μεταλλάξεις, αλλά και μέσα από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών που λειτουργούν ως υποδοχείς του ιού. Αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που παρατηρήθηκαν σε μεμ-βρανικές και διαμεμβρανικές πρωτεΐνες δείχνουν ότι μπορούν να προσφέρουν ανθε-κτικότητα έναντι λυτικών βακτηριοφάγων στο Vibrio alginolyticus. Τα ανθεκτικά στους ιούς στελέχη παρουσίασαν επίσης και φαινοτυπικές αλλαγές, όπως στο ρυθμό ανάπτυξης, αλλά και τους ενδοκυτταρικούς μεταβολίτες. Αυτές οι διαφορές συσχετί-στηκαν με αλλαγές στα σχετικά ποσοστά έκφρασης σακχάρων και αμινοξέων ABC, PTS και άλλων μεταφορέων. Ποιο συγκεκριμένα, οι μεταφορείς στόχοι έδειξαν πολύ μειωμένη έκφραση σε σχέση με τα μη ανθεκτικά στελέχη, ενώ κάποια επίπεδα έκφρα-σης ήταν κοντά στο μηδέν. Τέλος έγινε μελέτη στο μεταγραφικό πρότυπο βιοχημικών μονοπατιών που σχετίζονται με τον κύκλο του κιτρικού οξέος και τη βιοσύνθεση δια-φόρων απαραίτητων αμινοξέων. Πολλοί μηχανισμοί άμυνας των βακτηρίων έναντι των βακτηριοφάγων έχουν αναφερθεί ως τώρα, παρόλα αυτά οι μηχανισμοί που ενορ-χηστρώνουν τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό στα ανθεκτικά στελέχη παραμέ-νουν αρκετά ανεξερεύνητοι. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ανθεκτικά στελέχη μπορούν να μειώσουν την μεταγραφή μεμβρανικών πρωτεϊνών, όπως οι μεταφορείς θρεπτικών, και να επαναπρογραμματίσουν τον μεταβολισμό τους. Η παρούσα διδα-κτορική διατριβή προωθεί το γένος Vibrio για μελέτη των μηχανισμών άμυνας των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, απέναντι στους φυσικούς τους εχθρούς, εστιάζο-ντας στην ανθεκτικότητα που προκύπτει ως αποτέλεσμα μεταβολικής προσαρμογής και επαναπρογραμματισμού, ενώ ταυτόχρονα ενισχύει την πεποίθηση ότι για την α-ντιμετώπιση της ανάπτυξης ανθεκτικότητας των βακτηρίων κατά τη φαγοθεραπεία, απαιτείται η χρήση φαγικών κοκτέιλ.