Βιολογική και βιοηλεκτροχημική επεξεργασία για την απομάκρυνση μελανοϊδίνης από υδατικά συστήματα και απόβλητα και μελέτη της βιολογικής δραστικότητας της μελανοϊδίνης

Abstract

In the present thesis, synthetic melanoidin solutions were prepared by the reaction of glucose with amino acids glycine, lysine, glutamate and aspartic acid. Each melanoidin solutions of them was separated into fractions of low (<10 kDa) and high (> 10 kDa) molecular weight, by means of Amicon-type molecular filtration, and they are characterized for their antioxidant activity (using pyrogallol test and ABTS). A similar process was also carried out in an industrial melanoidin waste of ZANAE fermentation industry. At a following step of our research, the biological decolorization of melanoidin (synthetic and natural wastes) solutions of a concentration range of 1% - 50% v/v was studied using the following biocatalysts: laccase (an oxidase), bacterial strains (B. subtilis T. thermophilus, E. coli) and yeast cells (S. cerevisiae). The decolorization rate of melanidin was monitored in all above biological systems, by the decrease of its absorbance at 475 nm and by ADMI units. The biodecolorization results were attributed to laccase and peroxidase enzymes identifying their presence at extracellular culture fluids by performing the ABTS assay. Melanoidin induced both enzymatic activities over 50% compare to control. Subsequently, the secretion of these two enzymes in extracellular extracts of S. cerevisiae and T. thermophilus was demonstrated by non-denaturing electrophoresis experiments on acrylamide gel (native PAGE) and detection of enzymatic activities by in situ guaicol dye staining. These microorganisms were proved to be more effective as it concerns the melanoidin bio-treatment. The decolorization rate achieved by T. thermophilus and S. cerevisiae was 90% and ~80% respectively. In order to optimize the biotreatment conditions of natural and synthetic wastes, yeast cells were immobilized on alumina pellets and silica particles and a total melanoidin decolorization at 48 hours was achieved. Similarly, the laccase enzyme was also immobilized on alumina pellets and glass beads to perform the same process, with significantly lower bleaching rates.Finally, the bioelectrolytic melanoidin oxidation was investigated catalyzed by either the laccase enzyme or S. cerevisiae. The electrochemical behavior and the mechanism of all the components of the electrochemical cell were performed by cyclic voltammetry experiments. Cyclic voltammetry (CV) and constant potential electrolysis experiments were performed with the help of an Autolab PGSTAT302N potentiostat/galvanostat. All measurements were carried out in a three-necked round bottom cell at a total reaction mixture of 40 mL, in a conventional three-electrode configuration. An anode of a working graphite electrode with a surface of 0.385 cm2 was employed together with a platinum wire counter electrode and a saturated calomel reference electrode (SCE). Two electrochemical procedures have been studied for melanoidin solution (10% v/v) degradation: one employing pure laccase extracted from Trametes versicolor and the other using the microorganism S.cerevisiae. A pH= 5.5 phosphate buffer of K2HPO4 +KH2PO4 (100 mM and as electron mediator a 0.35 mM ABTS solution. The same procedure was performed by a carbon felt anode. Then a chronoamperometric curve recorded during the application of a constant electrolysis potential of +1.10 V at a graphite disc electrode in a solution containing ABTS+Sacch+MD, for a period of 6 h. A decolorization of 70% was achieved after a 6 h bioelectrolytic treatment of a 40 ml volume at a final current value 12 μΑ. When the anode was replaced by the carbon felt electrode the melanoidin decolorization rate was the same at a current value 1,76 mA. It is noteworthy that the kinetic data of heterogeneous catalysis for the immobilized S. cerevisiae systems on both media (silica and alumina) were evaluated and compared with those of the electrode (GR) to obtain a kinetic k value of 5.81 * 10 -5 m/s, which are over two times higher than that of the other two processes.The in vitro evaluation of the antioxidant activity of melanidin components showed that their concentration ranged between 0.89 and 1.6 mg / μL, prompted us to study the bioactivity of these substances against the T24 cancer cell lines and A549. The above cancer cell lines were exposed to melanoidin products of glucose- glycine, -lysine, -glutamate and -aspartic acid and it was demonstrated that the maximal cytotoxicity was obtained by the lysine AGEs (IC50 = 2.5 μg / mL) and the smallest of glycine (IC50> 20 μg / mL), using the SRB method. Subsequently, ROS and MDA products were assayed by NBT and MDA test, respectively, (in the presence and absence of H2O2), in order to explain the AGEs deleterious effects. The synthetic melanoidin products proved did not showed chemoprotective activity from peroxide free radicals against A549 cells and purified mitochondria, but a strong pro-oxidant behavior. Furthermore, the SOD enzymatic activity, assayed by pyrrogalol, was enhanced in the presence of AGEs (35- 40 U/mL) compared to that in their absence (5 U/mL). Finally, the AGEs inflammatory character was proved by immunoblotting techniques by determining the levels of protein factors COX-1 and ΤNF-α that gave a positive signal.

Στην παρούσα ερευνητική διαδικασία αρχικά παρασκευάστηκαν συνθετικά διαλύματα μελανοϊδίνης, μέσω της συμπύκνωσης της γλυκόζης με τα αμινοξέα γλυκίνη, λυσίνη, γλουταμινικό και ασπαραγινικό οξύ. Οι μελανοϊδίνες που προέκυψαν διαχωρίστηκαν σε μοριακά κλάσματα χαμηλής (<10 kDa) και υψηλής (>30 kDa) μοριακού βάρους, μέσω στηλών μοριακής διήθησης τύπου Αmicon, προκειμένου να ακολουθήσει ο χαρακτηρισμός των διάφορων προϊόντων μελανοϊδίνης ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση (δοκιμή πυρογαλλόλης και ABTS). Παρόμοια διαδικασία πραγματοποιήθηκε και στο φυσικό απόβλητο μελανοϊδίνης της βιομηχανίας ζυμών ΖΑΝΑΕ. Στην συνέχεια της μελέτης αυτής, διερευνήθηκε η βιολογική βιοαποικοδόμηση της μελανοϊδίνης (συνθετικής και πραγματικής), από διαλύματα της εύρους συγκεντρώσεων 1%- 50% v/v, με χρήση των βιοκαταλυτών της λακκάσης (οξειδάση), των βακτηριακών στελεχών Β. subtilis, T. thermophilus, E. coli και της ζύμης S. cerevisiae. Ο αποχρωματισμός της μελανοϊδίνης διαπιστώθηκε από όλα τα παραπάνω βιολογικά συστήματα μέσω της ελάττωσης της απορρόφησής της στα 475 nm και με μονάδες ADMI, ώστε να αποδοθεί στα ένζυμα της λακκάσης και της υπεροξειδάσης με ενζυμικές δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν με υπόστρωμα το ΑΒΤS. Ακολούθως με πειράματα μη αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης σε πηκτή ακρυλαμιδίου (native-PAGE), που πραγματοποιήθηκαν σε εξωκυττάρια εκχυλίσματα των μικροοργανισμών S. cerevisiae και Τ. thermophilus, αποδείχθηκε η έκκριση αυτών των δύο ενζύμων κατόπιν χρώσης τους με in situ βαφή με guaicol. Η βέλτιστη διαχείριση συνθετικών και πραγματικών αποβλήτων μελανοϊδίνης εκδηλώθηκε από τους μικροοργανισμούς Τ. thermophilus και S. cerevisiae με ποσοστά αποχρωματισμού πάνω από 90% και μέχρι 80%, αντίστοιχα. Εν συνεχεία, προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες αποχρωματισμού των φυσικών και συνθετικών αποβλήτων που περιεγράφηκαν, κύτταρα της ζύμης καθηλώθηκαν σε σωματίδια αλουμίνας και σφαιρίδια silica για να επιτευχθεί υψηλός έως πλήρης αποχρωματισμός των διαλυμάτων μελανοϊδίνης σε διάρκεια 48 ωρών, αντίστοιχα. Το ένζυμο της λακκάσης καθηλώθηκε επίσης σε σωματίδια αλουμίνας και σφαιρίδια γυαλιού για την διεξαγωγή της ίδιας βιοδιεργασίας, με σαφώς μικρότερα ποσοστά αποχρωματισμού. Εν κατακλείδι η μελέτη του βιοαποχρωματισμού των συνθετικών αποβλήτων μελανοϊδίνης γλυκόζης-γλυκίνης (10% v/v) ολοκληρώθηκε με τη διερεύνηση της βιο-ηλεκτρολυτικής οξείδωσης της μελανοϊδίνης, καταλυόμενης είτε από το ένζυμο της λακκάσης είτε από τον S. cerevisiae. Εν συνεχεία εκτιμήθηκε η ηλεκτροχημική συμπεριφορά και ο μηχανισμός στον οποίο συμμετέχουν όλα τα συστατικά τα οποία απαρτίζουν την ηλεκτρολυτική κυψέλη που κατασκευάστηκε, με πειράματα κυκλικής βολταμμετρίας. Ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιμοποιήθηκε αρχικά ένα ηλεκτρόδιο γραφίτη (GR) και μεταγενέστερα ένα που κατασκευάστηκε από ίνες άνθρακα, με διαμεσολαβητή φορτίου το ABTS (0.35 mM) ενώ ως φέροντας ηλεκτρολύτης επιλέχθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (100 mM KH2PO4-K2HPO4, pH=5). Σε σταθερή τιμή δυναμικού, ίση με +1,1 V, όπως εκτιμήθηκε με καμπύλες κυκλικής βολταμετρίας των συστημάτων των βιοκαταλυτών ABTS+Lac+MD και ABTS+Sac+MD, πραγματοποιήθηκαν πειράματα χρονο-αμπερομετρίας παρουσία του ηλετροδίου του γραφίτη. H τελική τιμή ρεύματος που καταγράφηκε και στις δύο περιπτώσεις ήταν 12 μΑ και το ποσοστό αποχρωματισμού που επιτεύχθηκε υπολογίστηκε περίπου 70% και στις δύο περιπτώσεις, μετά από την 6ωρη βιο-ηλεκτρολυτική διεργασία διαλύματος όγκου 40 mL. Όταν το ηλεκτρόδιο εργασίας αντικαταστάθηκε από αυτό που κατασκευάστηκε από ίνες άνθρακα η τελική τιμή του ρεύματος ήταν 1,76 mA ενώ το ποσοστό αποχρωματισμού ήταν το ίδιο. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κινητικά δεδομένα της ετερογενούς κατάλυσης για τα καθηλωμένα συστήματα του σακχαρομύκητα στα δύο μέσα (silica και αλουμίνα), εκτιμήθηκαν και συγκρίθηκαν με αυτά του ηλεκτροδίου (GR), με σταθερά ταχύτητας k ίση με 5,81*10-5 m/s, που είναι δύο τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη από αυτές των άλλων διεργασιών. Τα πειράματα αξιολόγησης του ποσοτικού προσδιορισμού της in vitro αντιοξειδωτικής δράσης της μελανοϊδίνης και των συστατικών της απέδειξαν ότι η συγκέντρωση αντιοξειδωτικών συστατικών κυμάνθηκε μεταξύ 0,89 και 1,6 mg/μL, αποτελώντας το εφαλτήριο για την μελέτη της βιοδραστικότητας των ουσιών αυτών έναντι των καρκινικών σειρών Τ24 και Α549. Οι δύο παραπάνω καρκινικές σειρές εκτέθηκαν στα συνθετικά προϊόντα μελανοϊδίνης της γλυκίνης, της λυσίνης, του γλουταμινικού και του ασπαραγινικού οξέος, και αποδείχθηκε ότι τη μέγιστη κυτταροτοξική δράση επέδειξαν τα AGEs της λυσίνης (IC50=2,5 μg/mL) και τη μικρότερη αυτά της γλυκίνης (IC50>20 μg/mL), με χρήση της μεθόδου SRB. Προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός μηχανισμός της τοξικής δράσης των ΑGEs πραγματοποιήθηκαν πειράματα που αφορούν την πρόκληση οξειδωτικού stress και τη λιπιδική υπεροξείδωση σε εξωκυττάρια εκχυλίσματα της κυτταρικής σειράς Α549 και σε ηπατικό εκχύλισμα μόσχου με τις μεθόδους NBT και ΜDA, παρουσία και απουσία ενός προοξειδωτικού παράγοντα (H2O2). Τα συνθετικά προϊόντα μελανοϊδίνης που προέκυψαν από τη γλυκόζη με τα αμινοξέα δεν επέδειξαν καμία χημειοπροστασία σε κύτταρα και σε καθαρά μιτοχόδρια in vitro, έναντι των ελεύθερων ριζών που σχηματίστηκαν από το H2O2, αλλά αντίθετα εκδηλώθηκε μάλλον έντονα ο προοξειδωτικός τους χαρακτήρας με την παρουσία των προϊόντων ROS και MDA να αυξάνεται παρουσία των AGEs παρά απουσία αυτών. Η ενζυμική δράση της SOD, όταν αυτή εκτιμήθηκε με υπόστρωμα την πυρρογαλόλη, πυροδοτήθηκε παρουσία των AGEs (35- 40 U/mL) παρά απουσία αυτών (5 U/mL). Οσον αφορά την πρόκληση φλεγμονής από τα AGEs, αυτή ελέγχθηκε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών της COX-1 και του ΤNF-α, παράγοντες που σχετίζονται με τη φλεγμονή του κυττάρου, σε εκχυλίσματα της κυτταρικής σειράς Α549, τα οποία έδωσαν θετικό σήμα.