Μελέτη της παθογένειας και συμβολή στη διάγνωση του ενζωοτικού ενδορρινικού νεοπλάσματος των προβάτων και αιγών

Abstract

Aim of research was the study of gross/histopathological lesions and the detection of the causative agent (ENTV-1 & -2, for sheep and goats, respectively) of Enzootic Nasal Adenocarcinoma (ENA) of small ruminants. In order to achieve these objectives, we collected and examined 23 goats and 44 sheep with compatible clinical signs and visible intranasal mass. Twenty two out of the 44 sheep and the 23 goats originated from Greece, while the remaining sheep originated from Cyprus. Examination of the above-mentioned animals was based on the application of clinical/laboratory methods (clinical / hematological-biochemical, cytological examination), pathological findings (gross, histopathological, indirect immunoperoxidase immunohistochemical examination) and molecular techniques. In total, 4 molecular assays were developed to detect ENTV-1 and -2 from nasal swabs, and the corresponding proviruses from neoplastic tissue. Pathological findings of Greek goats and Cypriot sheep were compatible with ENA, since they exhibited intranasal masses, histologically classified as low grade adenocarcinomas. However, the intranasal masses of Greek sheep were histologically manifesting proliferative rhinitis. Immunohistochemical examination against ENTV-1, showed positive reaction only for the Cypriot sheep. Application of the developed molecular assays confirmed the presence of ENTV-2 in all Greek goats with ENA, while ENTV-1 was only detected in Cyprus sheep. ENA in Greek sheep has not been identified and we performed bacteriological culture and serological identification and a novel real-time PCR was developed for etiological diagnostic purposes. These assays demonstrated the presence of Salmonella enterica subsp. diarizonae (SED) as the causative agent of chronic proliferative rhinitis in Greek sheep for the first time. From the clinical, hematological, biochemical and cytological examination of the ENA cases, the following conclusions were reached: a) auscultatory findings wheezing and snoring with tension at nasal cavities and larynx may be suspected of the disease. (b) ENA-affected goats often exhibit mild mucosal anemia, mild normocytic and normal hemoglobin level anemia, selective hyperglobulinemia and decreased creatinine concentration. (c) Cytology does not provide a reliable diagnosis. Pathological findings suggest that caprine ENA tends to occupy the entire space of the nasal cavities and to extend backwards (nasopharynx), while in sheep is restricted to the middle area of the nasal cavities and extended mainly upwards (ocular cavity, frontal sinus). The most frequent type of tumor growth pattern in goats was tubular, whereas in sheep papillary and consequently caprine ENA is usually derived from the olfactory glands, while in sheep from the mucosal glands of the respiratory mucosa. ENA was strongly correlated with glandular hyperplasia / dysplasia of nasal mucosa in goats and sheep, reinforcing the hypothesis that this finding is the initial indication of malignancy. The developed molecular assays can accurately and reliably detect ENTV-1 and -2, as well as the corresponding proviruses. RT-qPCR is the first method for the detection and quantification of ENTV-2 in goats using minimally invasive sampling technique. Its application in a goat herd, revealed remarkably high virus prevalence, identifying ENA-affected goats, as well as asymptomatic virus carriers. These molecular assays may have future applications in surveillance and control disease programs aiming at eradication of ENA.

Στόχοι της διατριβής ήταν η μελέτη των παθολογοανατομικών αλλοιώσεων και η ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα του Ενζωοτικού Ενδορρινικού Αδενοκαρκινώματος (ΕΕΑ) (ΕNTV-1 & -2, για πρόβατα και αίγες αντίστοιχα). Για την υλοποίησή τους, συλλέξαμε 23 και 44 περιστατικά αιγών και προβάτων, αντίστοιχα, με συμβατή κλινική εικόνα και ενδορρινική μάζα. Οι 23 αίγες και 22/44 πρόβατα προέρχονταν από την Ελλάδα, ενώ τα υπόλοιπα πρόβατα από την Κύπρο. Τα παραπάνω ζώα εξετάσθηκαν με κλινικό-εργαστηριακές (κλινική/αιματολογική-βιοχημική και κυτταρολογική εξέταση), παθολογοανατομικές (μακροσκοπική, ιστοπαθολογική, έμμεση ανοσοϊστοχημική μέθοδος της ανοσοϋπεροξειδάσης) και ιολογικές τεχνικές. Αναφορικά με τις τελευταίες, αναπτύχθηκαν συνολικά 4 μοριακές δοκιμές για την ανίχνευση των ENTV-1 και -2 από ενδορρινικούς στειλεούς, και των αντίστοιχων προϊών σε νεοπλασματικούς ιστούς. Οι παθολογοανατομικές αλλοιώσεις των ελληνικών αιγών και των κυπριακών πρόβατων ήταν συμβατές με ΕΕΑ, δηλαδή παρουσίαζαν ενδορρινικές μάζες που κατατάχθηκαν ιστολογικά ως αδενοκαρκινώματα καλής διαφοροποίησης. Αντίθετα, οι ενδορρινικές μάζες των ελληνικών πρόβατων εμφανίζονταν ιστολογικά ως υπερπλαστική ρινίτιδα. Κατά την ανοσοϊστοχημική εξέταση ανίχνευσης του ENTV-1, διαπιστώθηκαν θετικές μόνο οι τομές των κυπριακών προβάτων. Οι ανεπτυγμένες μοριακές δοκιμές επιβεβαίωσαν την παρουσία του ENTV-2 σε όλες τις ελληνικές αίγες με ΕΕΑ, ενώ ο ENTV-1 ανιχνεύθηκε μόνο στα κυπριακά πρόβατα. Δεν διαπιστώθηκαν περιστατικά ΕΕΑ ελληνικών προβάτων και για την αιτιολογική διάγνωση της παθολογικής τους κατάστασης διενεργήθηκε καλλιέργεια, ορολογική ταυτοποίηση και αναπτύχθηκε νέα μοριακή δοκιμή PCR πραγματικού χρόνου. Καταδείχθηκε η Salmonella enterica υποείδ. diarizonae (SED) ως αιτιολογικός παράγοντας, τεκμηριώνοντας για πρώτη φορά την παρουσία της SED στην Ελλάδα και της χρόνιας υπερπλαστικής ρινίτιδας που αυτή προκαλεί στα πρόβατα. Από την κλινική, αιματολογική-βιοχημική και κυτταρολογική εξέταση των περιστατικών ΕΕΑ προέκυψαν τα εξής: (α) τα ακροαστικά ευρήματα συριγμοί και ρόγχοι με ιδιαίτερη ένταση στο επιρρίνιο και τo λάρυγγα μπορούν να θέσουν υποψία ΕΕΑ. (β) Οι αίγες με ΕΕΑ, συχνά εμφανίζουν ήπια αναιμικούς βλεννογόνους, ήπιου βαθμού ορθοκυτταρική και ορθόχρωμη αναιμία, επιλεκτική υπερσφαιριναιμία και μειωμένη συγκέντρωση κρεατινίνης. (γ) Η κυτταρολογική εξέταση δεν προσφέρει αξιόπιστη διάγνωση. Βάσει των παθολογοανατομικών ευρημάτων προκύπτει ότι το ΕΕΑ των αιγών εμφανίζει μεγαλύτερη τάση κατάληψης του διαθέσιμου χώρου των ρινικών κοιλοτήτων και επέκτασης οπίσθια (ρινοφάρυγγας), ενώ στα πρόβατα περιοριζόταν μέχρι το μέσο των ρινικών κοιλοτήτων και επεκτεινόταν κυρίως προς τα άνω (οφθαλμική κόγχη, μετωπιαίος παραρρινικός κόλπος). Στις αίγες, ο συχνότερος τύπος ανάπτυξης του νεοπλάσματος ήταν ο σωληνοειδής, ενώ στα πρόβατα ο θηλοειδής, συμπεραίνοντας πως το ΕΕΑ των αιγών συνήθως προέρχεται από τους οσφρητικούς αδένες, ενώ των προβάτων από τους βλεννογόνους αδένες του αναπνευστικού βλεννογόνου. Παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση του ΕΕΑ αιγών και προβάτων με την παρουσία υπερπλασίας/δυσπλασίας των αδένων του ρινικού βλεννογόνου, ισχυροποιώντας την άποψη ότι το συγκεκριμένο εύρημα αποτελεί αρχική ένδειξη κακοήθειας. Οι ανεπτυγμένες μοριακές δοκιμές ανιχνεύουν με ακρίβεια, αξιοπιστία και ταχύτητα τους ENTV-1 & -2 και τους αντίστοιχους προϊούς. Η RT-qPCR αποτελεί την πρώτη μέθοδο ανίχνευσης του ENTV-2 στις αίγες με ελάχιστα επεμβατική δειγματοληψία. Η χρήση της αποκάλυψε αξιοσημείωτα υψηλό επιπολασμό του ιού εντός ενός ποιμνίου αιγών, εντοπίζοντας τόσο τις αίγες με ΕΕΑ, όσο και ασυμπτωματικές αίγες-φορείς. Μελλοντικά, οι μοριακές αυτές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε προγράμματα επιτήρησης για την εκρίζωση του ΕΕΑ.