Investigations on protein arginine methyltransferases in differentiation and cancer

Abstract

Methylation of arginine residues by the family of Protein Arginine Methyltransferase (PRMT) enzymes is an important modulator of protein function that is involved in epigenetic regulation of gene expression, DNA damage response, RNA maturation and cell signaling. The pre-mRNA of the predominant enzyme of the family, PRMT1, is alternatively spliced in the 5’- end and produces seven different isoforms. PRMT1 isoforms vary in their aminoterminal region, are expressed at different levels in different tissues, and have distinct substrate specificity and intracellular localization. Here, we characterize a novel splicing isoform of PRMT1, which lacks introns 8 and 9. These exons encode the dimerization arm of the enzyme that is essential for PRMT1 enzymatic activity. Consequently, the isoform does not form catalytically active oligomers with the other endogenous PRMT1 isoforms. Photobleaching experiments reveal an immobile fraction of the enzyme in the nucleus, in accordance with earlier results from our laboratory that had shown a tight association of inhibited or inactivated PRMT1 with chromatin and the nuclear scaffold. This isoform is detected in a variety of cell lines, but it is expressed at higher levels in cancer cells and it is further induced by the EMT-inducing transcription factor Snail. Thus, the novel isoform could act as a modulator of PRMT1 activity in cancer cells by acting as a competitive inhibitor that shields substrates from access to active PRMT1 oligomers. Moreover, we provide evidence that lamin B receptor (LBR) is a novel PRMT1 substrate, which might contribute to the epigenetic regulation of gene expression through non-histone substrates. The second part of the thesis focuses on PRMT8, a protein that shares a high degree of homology with PRMT1, but is mainly expressed in the central nervous system. Until now, PRMT8 was poorly studied due to the lack of appropriate tools. However, in the present thesis, we generated several tools and performed a wide variety of experiments in order to determine the physiological role of PRMT8 in neuronal differentiation and maintenance. We find that in a neuronal cell system, LUHMES, PRMT8 expression is induced during differentiation. A recombinant PRMT8:GFP construct accumulates in the nucleus while LUHMES cells are differentiating. Furthermore, we provide evidence that the amount of the protein in the nucleus cannot exceed certain levels and reach a plateau when the total amount of the protein increases in the cell. Moreover, we generated and validated lentiviral vectors to succesfully achieve the knock-down of endogenous PRMT8, and to identify interaction partners and substrates through the use of the BioID method in future experiments. Collectively, the work described in the present thesis shows that PRMT1 and PRMT8 have important roles in cancer and neuronal differentiation, respectively. The new knowledge will be instrumental to further investigations, which will elucidate the potential use of PRMT1 and PRMT8 as diagnostic markers or drug targets in cancer and neurodegenerative diseases.

Η μεθυλίωση των καταλοίπων αργινίνης από την οικογένεια των μεθυλοτρανσφερασών της αργινίνης (Protein Arginine Methyltransferases, PRMTs) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της λειτουργίας των πρωτεϊνών και εμπλέκεται σε διαδικασίες όπως: η επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, οι αποκρίσεις σε βλάβες του γενετικού υλικού, η ωρίμανση του RNA και η κυτταρική σηματοδότηση. Ο κυριότερος εκπρόσωπος της οικογένειας των ενζύμων αυτών είναι η PRMT1, από το γονίδιο της οποίας παράγονται εφτά διαφορετικές ισομορφές μετά από εναλλακτικό μάτισμα του αρχικού μεταγράφου στο 5’ άκρο. Οι ισομορφές αυτές εκφράζονται σε διαφορετικά επίπεδα ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, επιδεικνύουν διακριτή ειδικότητα για συγκεκριμένα υποστρώματα καθώς και διαφορετικό υποκυττάριο εντοπισμό. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, ανακαλύψαμε μια νέα ισομορφή της PRMT1 που δε σχετίζεται με το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης, όπως οι εφτά γνωστές έως τώρα ισομορφές. Η νέα αυτή ισομορφή δεν εμπεριέχει τα εξόνια 8 και 9 τα οποία είναι υπεύθυνα για την κωδικοποίηση του βραχίονα διμερισμού του ενζύμου. Εξαιτίας αυτού, το ένζυμο δεν μπορεί να δημιουργήσει καταλυτικά ενεργά ολιγομερή με τις υπόλοιπες ισομορφές του. Πειράματα FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching) έδειξαν την ύπαρξη ενός ακινητοποιημένου κλάσματος της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σύμφωνα με παλιότερα ευρήματα του εργαστηρίου μας, που έδειξαν ότι υπάρχει ισχυρή πρόσδεση της ανενεργής ή ανεσταλμένης PRMT1 στη χρωματίνη και στο πυρηνικό ικρίωμα (nuclear scaffold). Η νέα ισομορφή μπορεί να προσδεθεί στα ίδια υποστρώματα με την ενζυματικά ενεργή PRMT1. Η έκφραση της ανιχνεύθηκε σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και ήταν αυξημένη σε αυτές με τα πιο έντονα καρκινικά χαρακτηριστικά ή μετά από την υπερέκραφαση του μεταγραφικού παράγοντα Snail που επάγει τη μετάπτωση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα (ΕΜΤ). Θεωρούμε ότι η νέα ισομορφή μπορεί να λειτουργήσει ως ρυθμιστής της δράσης της PRMT1 στα καρκινικά κύτταρα, δρώντας ως ανταγωνιστικός αναστολέας που δεν επιτρέπει την πρόσβαση των ενεργών ολιγομερών της PRMT1 στα υποστρώματά τους. Επίσης, παρουσιάζουμε νέα δεδομένα που καταδεικνύουν ότι ο υποδοχέας της λαμίνης Β (Lamin B Receptor, LBR) αποτελεί υπόστρωμα της PRMT1, κάτι που δεν ήταν γνωστό μέχρι σήμερα. Η μεθυλίωση του LBR από την PRMT1, πιθανώς να αποτελεί μέρος της επιγενετικής ρύθμισης των γονιδίων μέσω υποστρωμάτων που δεν ανήκουν στην οικογένεια των ιστονών. Στο δεύτερο τμήμα της διδακτορικής διατριβής, μελετήσαμε την PRMT8, το όγδοο μέλος της οικογένειας των PRMTs. Η αλληλουχία της PRMT8 είναι κατά ένα μεγάλο ποσοστό ομόλογη με αυτήν της PRMT1, αλλά η έκφραση της είναι περιορισμένη στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Μέχρι σήμερα, η PRMT8 δεν είχε μελετηθεί ενδελεχώς, εξαιτίας της έλλειψης κατάλληλων εργαλείων και κυτταρικών συστημάτων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύξαμε νέα εργαλεία και διεξαγάγαμε μία σειρά πειραμάτων με σκοπό να διερευνήσουμε τον φυσιολογικό ρόλο της PRMT8 στη διαφοροποίηση και τη διατήρηση του νευρικού ιστού. Από τα πειράματα μας, προκύπτει ότι η PRMT8 εκφράζεται ενδογενώς στο κυτταρικό μοντέλο νευρικής διαφοροποίησης, LUHMES (LUnd Human MESencephalon). Η υπερέκφραση της PRMT8, συντηγμένης με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein, GFP), κατέδειξε ότι η PRMT8 συσσωρεύεται στον πυρήνα καθώς τα LUHMES διαφοροποιούνται. Βάσει των αποτελεσμάτων μας φαίνεται ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης στον πυρήνα δεν μπορούν να ξεπεράσουν ένα όριο ανεξάρτητα από τη συνολική ποσότητά της στο κύτταρο. Τέλος, κατασκευάσαμε και αξιολογήσαμε νέους φορείς λέντι-ιών για την αποσιώπηση της έκφρασης της PRMT8 και την ανίχνευση μορίων με τα οποία αλληλεπιδρά μέσω της μεθόδου που ονομάζεται BioID. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής μου αποδεικνύουν ότι η PRMT1 και η PRMT8 επιτελούν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο και στη νευρική διαφοροποίηση, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά θα έχουν μεγάλη χρησιμότητα σε επόμενες μελέτες όπου θα διερευνηθεί η πιθανότητα χρήσης τους ως διαγνωστικά εργαλεία ή φαρμακευτικοί στόχοι στον καρκίνο και σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες.