Διερεύνηση του ρόλου παραγόντων που συμμετέχουν στη διαδικασία πολυαδενυλίωσης του μηνύματος RNA στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού

Abstract

The formation of the 3΄ end of mRNA involves the selection of the poly(A) site and the addition of the poly (A) tail which plays a role in translocation to the cytoplasm, stability and translation. The selection of non-canonical poly (A) signals appears to be a regulated process associated with the increased expression of oncogenes (which possess multiple poly(A) signals) and with highly proliferating cells. Poly(A) polymerase alpha (PAPOLA) is one of the entities responsible for mRNA polyadenylation and 3΄ end formation. Since high levels of poly(A) polymerase activity have been proposed as an independent unfavorable prognostic factor in node-negative breast cancer patients, we aimed to investigate any possible contribution of PAPOLA to the malignant phenotype of breast cancer and to elucidate the underlying mechanisms through which PAPOLA may promote carcinogenesis. PAPOLA expression levels were evaluated by immunohistochemical staining of breast cancer tissues. PAPOLA expression strongly correlated with sporadic rather than familial breast cancer, triple negative breast cancer, lobular histological type and progesterone receptor negative tumors. Furthermore, within the well differentiated, Grade I tumor category, PAPOLA was associated with adverse prognostic factors (tumor’s size, advanced TNM stage, survival status).Silencing PAPOLA in MCF-7 and MDA-MB 231 breast cancer cells resulted in reduction of proliferation and a higher fraction of cells in G0/G1 phase of cell cycle. Moreover, the lack of PAPOLA reduced anchorage independent growth. Also, preliminary experiment showed that silencing PAPOLA increased breast cancer cells chemosensitivity to Paclitaxel. Surprisingly, overexpressing PAPOLA in MCF-7 and HEK 293 cells resulted in inhibition of proliferation and eventually cell death. Furthermore, an increase in the levels of the tumor suppressor p53 and the 89KD fragment of PARP implied the initiation of the apoptotic process. On the other hand, overexpressing PAPOLA in MDA-MB 231 cells, which carry a mutant p53, promoted cell proliferation as well a dramatic increase of the size of their colonies in soft agar.Silencing PAPOLA in MCF-7 and MDA-MB 231 cells led to reduced cyclin D1 (CCND1) levels, both in terms of mRNA and protein, whereas overexpression resulted in up regulation in the cells that could tolerate it. Furthermore, PAPOLA promoted the alternative polyadenylation of the corresponding mRNA since low expression levels of PAPOLA resulted in higher representation of the isoform with the longer 3΄ UTR of CCND1 mRNA, whereas overexpression of the enzyme had the opposite effect. No changes in the poly(A) tail length were observed in MCF-7 cells lacking PAPOLA, whereas high levels of the enzyme in MDA-MB 231 cells resulted in the lengthening of the poly(A) tail of both the mRNA isoforms. The poly(A) tail analysis also revealed that long transcripts acquire a shorter poly(A) tail compared to alternative polyadenylated counterparts. In conclusion it appears that overexpression of PAPOLA in breast cancer contributes to the malignant phenotype by lengthening the poly(A) tail and promoting alternative polyadenylation of mRNAs and thus increasing the expression of genes such as CCND1.

H διαμόρφωση του 3΄άκρου του mRNA περιλαμβάνει την επιλογή του σήματος πολυαδενυλίωσης και την προσθήκη της ουράς του πολυ(Α) η οποία συμμετέχει στη μετατόπιση από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, τη σταθερότητα και την αποτελεσματική μετάφραση. Η επιλογή μη καθιερωμένων θέσεων πολυαδενυλίωσης είναι μια ρυθμιζόμενη διαδικασία που συνοδεύεται από αυξημένη έκφραση ογκογονιδίων (που φέρουν πολλαπλά σήματα πολυαδενυλίωσης) και αυξημένο πολλαπλασιασμό.Η πολυ(Α) πολυμεράση α (PAPOLA) συμμετέχει καθοριστικά στη διαμόρφωση του 3΄άκρου τους mRNA. Δεδομένου ότι αυξημένη ενεργότητα των ενζύμων πολυαδενυλίωσης αποτελούν αρνητικό προγνωστικό παράγοντα στον καρκίνο του μαστού, στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η πιθανή συνεισφορά της PAPOLA στον καρκινικό φαινότυπο και ταυτόχρονα οι πιθανοί υποκείμενοι μηχανισμοί που συμβάλουν στα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων.Η μελέτη της έκφρασης της PAPOLA μέσω ανοσοϊστοχημείας σε καρκινώματα μαστού έδειξε ισχυρή συσχέτιση με το σποραδικό καρκίνο, με τον τριπλά αρνητικό υπότυπο καρκίνου του μαστού, με το λοβιακό ιστολογικό τύπο, καθώς και με τα αρνητικά για προγεστερονικούς υποδοχείς καρκινώματα. Επιπλέον, στους καλά διαφοροποιημένους όγκους (Grade I), η έκφραση της PAPOLA συσχετίστηκε με δυσμενείς παράγοντες πρόγνωσης (το μέγεθος όγκου, το προχωρημένο στάδιο νόσου, τα χαμηλά ποσοστά επιβίωσης).Η αποσιώπηση του γονιδίου της PAPOLA στις καρκινικές σειρές μαστού MCF-7 και MDA-MB 231 προκάλεσε την αναστολή του πολλαπλασιασμού και μετατόπιση των κυττάρων στη G0/G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και μείωση της ικανότητας των κυττάρων να αναπτύσσουν αποικίες σε ημι-στερεή καλλιέργεια. Επιπλέον, προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι η αποσιώπηση του γονιδίου της PAPOLA ενίσχυσε τη χημειοευαισθησία των κυττάρων στον αντικαρκινικό παράγοντα Paclitaxel.Απροσδόκητα, η υπερέκφραση της PAPOLA στα MCF-7 και HEK 293 κύτταρα οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού τους και επακόλουθο κυτταρικό θάνατο. Η αύξηση των επιπέδων της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 και της πέψης της PARP, υποδηλώνουν την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μηχανισμού.Η υπερέκφραση της PAPOLA στα MDA-MB 231 κύτταρα οδήγησε σε προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και δραματική αύξηση του μεγέθους των αποικιών των κυττάρων, όταν αυτά καλλιεργήθηκαν σε ημι-στερεή καλλιέργεια.Αποσιώπηση της PAPOLA οδήγησε σε μείωση των επιπέδων της κυκλίνης D1(CCND1) σε επίπεδο πρωτεΐνης και σε mRNA, τo οποίο υφίσταται τη διαδικασία της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης, ενώ υπερέκφρασή της, όπου ήταν ανεκτή, σε αντίστοιχη αύξηση. Επιπλέον, προέκυψε ότι η PAPOLA συνεισφέρει στην εναλλακτική πολυαδενυλίωση του mRNA της CCND1 καθότι η αντιπροσώπευση της μεγάλου μήκους ισομορφής του mRNA της CCND1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη των επιπέδων έκφρασης της PAPOLA.Αποσιώπηση της PAPOLA στα κύτταρα, δεν επηρέασε το μήκος της πολυ(Α) ουράς του mRNA της CCND1, ενώ αντίθετα κατά την υπερέκφρασή της παρατηρήθηκε επιμήκυνση των πολυ(Α) αλυσίδων. Επίσης, η μεγάλου μήκους ισομορφή mRNA της CCND1 συνοδευόταν από μια μικρότερου μήκους πολυ(Α) ουρά, σε αντίθεση με τη βραχεία ισομορφή η οποία φέρει μια μεγάλου μήκους αλυσίδα.Συμπερασματικά, προκύπτει ότι η υπερέκφραση της PAPOLΑ που παρατηρείται στον καρκίνο του μαστού μπορεί να συνεισφέρει στο καρκινικό φαινότυπο μέσω ενίσχυσης του μήκους της πολυ(Α) ουράς, της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης και ως εκ τούτου της έκφρασης mRNA με ογκογόνο δράση.