Ανάπτυξη επισημασμένων παραγώγων του νευροπροστατευτικού πεπτιδίου ουμανίνη για βιολογικές μελέτες

Abstract

Colivelin (CL) is a hybrid 26-peptide (SALLRSIPAPAGASRLLLLTGEIDLP) andthe most potent member of the humanin (HN) family of neuroprotective peptideswith in vitro and in vivo rescuing action against insults related to Alzheimer’sdisease. The objective of the present study is the synthesis and structuralcharacterization of new derivatives of CL, aiming at unraveling the still unknownmode of action of these peptides.In this frame, three new CL derivatives bearing suitable labeling moieties weredesigned and synthesized. The tag molecules are: i. the fluorescent moiety FITC(CL-FITC), ii. the streptavidin-counterpart biotin (CL-biotin), and iii. the 99mTcradiometalchelating unit dimethylGly-Ser-Cys (CL-CSG). The peptides weresynthesized according to Fmoc-solid phase peptide synthesis strategy, purifiedwith semi-preparative RP-HPLC and characterized with ESI-MS and NMR.Structural and cell-toxicity evaluation of the derivatives, using NMR and ΜΤΤassay respectively, revealed that the presence of the tags does not introduceany modification at conformation of CL neither affect cell viability, rendering thederivatives safe for use in various assays.Fluorescence microscopy studies using CL-FITC showed localization of CL toF11 cell periphery. Reduced fluorescence intensity upon pre-treatment withexcess of unlabeled CL indicated specific binding.CL-CSG was successfully complexed with 99mTc and utilized in biodistributionstudies. Based on our results, radioactivity was detected in brain 2 min p.i andexcreted mainly through the urinary tract.The results of a (biotin-streptavidin) ELISA-type assay, utilizing CL-biotin, in combination with CD experiments support interaction of CL with β-amyloid peptide.

H κολιβελίνη (CL) είναι ένα υβριδικό 26-πεπτίδιο (SALLRSIPAPAGASR--LLLLTGEIDLP) και το πλέον δραστικό μέλος της νευροπροστατευτικής οικογένειας πεπτιδίων της ουμανίνης (HN) με in vitro και in vivo δράση έναντι τοξικών εκδηλώσεων που σχετίζονται με τη νόσο Alzheimer (ΑD). Αντικείμενο της παρούσας Διατριβής είναι η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός νέων παραγώγων της CL, με απώτερο στόχο την ευρεία εφαρμογή τους στην διερεύνηση του τρόπου δράσης της οικογένειας της ΗΝ. Στο πλαίσιο αυτό, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν τρία νέα παράγωγα της CL τα οποία φέρουν ομάδες-ιχνηθέτες: α) την φθορίζουσα ένωση FITC (CL-FITC), β)την βιοτίνη – ένωση που σχηματίζει εξαιρετικά σταθερά σύμπλοκα με την πρωτεΐνη στρεπταβιδίνη (CL-βιοτίνη) και γ) το τριπεπτίδιο dimethylGly-Ser-Cys,χηλικό υποκαταστάτη του ραδιενεργού μετάλλου 99mTc (CL-CSG). Η σύνθεση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την Fmoc στρατηγική σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση, ο καθαρισμός έγινε με ημιπαρασκευαστική RP-HPLC και ο χαρακτηρισμός με ESI-MS και φασματοσκοπία NMR.Δομική ανάλυση των παραγώγων με φασματοσκοπία NMR καθώς καιπειράματα κυτταροτοξικότητας με την μέθοδο ΜΤΤ έδειξαν ότι η εισαγωγή της ομάδας-ιχνηθέτη δεν επιφέρει αλλαγές στην διαμόρφωση της CL ούτε καθιστά τοξικά τα νέα παράγωγα. Μελέτες μικροσκοπίας φθορισμού με τη χρήση του παραγώγου CL-FITC έδειξαν πρόσδεση στην μεμβράνη των υβριδικών κυττάρων F11, η οποία ελαττώνεται όταν τα κύτταρα προεπώαζονται με περίσσεια CL. Σύμπλεξη του CL-CSG με 99mTc και in vivo πειράματα βιοκατανομής σε φυσιολογικούς ποντικούς έδειξαν την παρουσία ραδιενέργειας στον εγκέφαλο 2 min p.i. και απέκκριση μέσω του ουροποιητικού. Τέλος, in vitro μελέτες αλληλεπίδρασης του παραγώγου CL-βιοτίνη με το β-αμυλοειδές πεπτίδιο της AD με μέθοδο τύπου ELISA (βιοτίνης/στρεπταβίνης), σε συνδυασμό με πειράματα κυκλικού διχρωισμού, δείχνουν αλληλεπίδραση της CL με το β-αμυλοειδές πεπτίδιο.