Μελέτη του μηχανισμού ρύθμισης της ρετρομετάθεσης: η περίπτωση των ρετρομεταθετών στοιχείων SVA

Abstract

Composite retrotransposons SVA (SINE-R, VNTR, Alu) are the evolutionarily youngest family of complex retrotransposons in hominoids. They are present in ~ 2670 copies in the human genome reference sequence and have been implicated in causing genetic diseases (Leukemia, neurofibromatosis etc) through various mechanisms. It has been suggested that they are mobilized by the ORF2 LINE-1 protein whereas their transcriptional regulation remains highly obscured.In the present study, we recovered the full-length SVAs of the human genome using UCSC database. Following categorization according to their genomic location, we found that the vast majority of SVAs are adjacent to the transcription start site, or within genes. In order to isolate an active SVA, specific primers were designed and used to clone SVA transcripts from leukemic cells. Nucleotide comparison (BLAST-NCBI) proved the homology with SVA elements and cloned sequences were mapped to the human genome. DNA was extracted from blast cells of a patient with acute B-lymphoblastic leukemia and an SVA-C, residing in the first intron of the SMOC-1 gene (SVASMOC1-L) was cloned. Remarkably, it was characterized by a 347 nucleotide truncation in the VNTR region compared to the corresponding reference SVA in the human genome.SVASMOC1-L was labeled with an EGFP-based retrotransposition cassette (SVA /EGFP-INT), designed to detect EGFP expression solely upon the occurrence of an SVA retrotransposition event. Following transfection and FACS analysis of cell clones, we found that retrotranspositionally positive cells were 0.1-32% of total cells in A549 single and massive clone cells, 0.5-4.8% in massive and single HeLa clones, and 4.7-6.3% in H1299 massive clones. Transfection of HUT-78 and Jurkat cells resulted in high retrotransposition frequencies reaching 31.7- and 70.8%, respectively. Retrotransposition events were detected in most cases by means of EGFP-positive cells by UV microscopy and further identified as genomic insertions by PCR analysis. Elevated retrotransposition events were associated with phenotypic changes, autophagic phenomena, acquisition of invasiveness and stem cell properties in A549 cells. In A549 clone cells, SVASMOC1-L was mobilized by: a. ORF2-LINE-1 reverse transcriptase, b. deacetylase inhibitors (Trichostatin-A, valproic acid), c. the anti-cancer drug Etoposide and d. induced oxidative stress by hydrogen peroxide and arsenic.The results of this study demonstrate for the first time that: 1. a VNTR-truncated SVA retrotransposon is active, 2. proliferating cells, such as cancer cells, provide an amenable environment for generation of retrotransposition events and 3. an SVA with a high retrotransposition-potential may contribute to the malignant progression of leukemia

Τα σύνθετα ρετροτρανσποζόνια SVA (SINE-R, VNTR, Alu) αποτελούν την εξελικτικά νεότερη οικογένεια σύνθετων ρετρομεταθετών στοιχείων στο ανθρώπινο γένωμα. Απαντώνται σε ~2670 αντίγραφα και ενοχοποιούνται για την πρόκληση γενετικών ασθενειών (πχ. λευχαιμία, νευροϊνωμάτωση κλπ) με διάφορους μηχανισμούς. Έχει υποστηριχθεί ότι κινητοποιούνται από την πρωτεΐνη ORF2 των LINE-1 ωστόσο η μεταγραφική τους ρύθμιση παραμένει άγνωστη σε μεγάλο βαθμό.Στην παρούσα μελέτη ανακτήθηκαν, αρχικά, τα πλήρους μήκους SVA του ανθρώπινου γενώματος μέσω της βάσης δεδομένων UCSC. Έγινε κατηγοριοποίηση ανάλογα με τη γενωμική τους θέση και βρέθηκε ότι σχεδόν το σύνολο των SVA εδράζονται παρακείμενα στη θέση έναρξης της μεταγραφής ή εντός γονιδίων. Με στόχο την απομόνωση ενός ενεργού SVA, χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί εκκινητές και κλωνοποιήθηκαν μεταγραφήματα SVA από κύτταρα λευχαιμικού ασθενούς. Μέσω νουκλεοτιδικής σύγκρισης (BLAST-NCBI) αποδείχτηκε η ομολογία με ακολουθίες SVA οι οποίες και χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γένωμα. Χρησιμοποιώντας DNA από βλάστες ενός ασθενή με οξεία Β-λεμφοβλαστική λευχαιμία κλωνοποιήθηκε το SVA-C που εδράζεται στο 1ο ιντρόνιο του γονιδίου SMOC-1 (SVASMOC1-L). Ωστόσο αυτό χαρακτηρίστηκε από έλλειψη 347 νουκλεοτιδίων στην περιοχή VNTR σε σχέση με το αντίστοιχο SVA στο γονιδίωμα αναφοράς.Το SVASMOC1-L σημάνθηκε με ειδική κασέτα ανίχνευσης ρετρομετάθεσης που εξασφαλίζει την έκφραση της φθορισμογόνου πρωτεΐνης EGFP αποκλειστικά και μόνο, έπειτα από ένα γεγονός ρετρομετάθεσης (SVA/EGFP-INT). Μετά από διαμόλυνση και ανάλυση FACS σε κυτταρικούς κλώνους βρέθηκε ότι τα θετικά σε ρετρομετάθεση κύτταρα αποτελούσαν το 0.1-32% του συνόλου σε μαζικούς και μονήρεις κλώνους Α549, το 0.5-4.8% σε μαζικούς και μονήρεις κλώνους HeLa και το 4.7-6.3% σε μαζικούς κλώνους Η1299. Διαμόλυνση σε κύτταρα HUT-78 και Jurkat απέδωσε συχνότητες ρετρομετάθεσης 31.7- και 70.8%, αντίστοιχα. Τα γεγονότα ρετρομετάθεσης ανιχνεύθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις μέσω EGFP-θετικών κυττάρων με μικροσκοπία UV, τα οποία περαιτέρω πιστοποιήθηκαν ως γενωμικές ενσωματώσεις με ανάλυση PCR. Τα αυξημένα γεγονότα ρετρομετάθεσης συσχετίστηκαν σε κύτταρα Α549 με αλλαγή φαινοτύπου, φαινόμενα αυτοφαγίας, απόκτηση διηθητικότητας και ιδιοτήτων βλαστικών κυττάρων. Σε κύτταρα κλώνων Α549, βρέθηκε ότι το SVASMOC1-L μπορεί να κινητοποιηθεί από: α. την αντίστροφη μεταγραφάση ORF2 των LINE-1, β. αναστολείς των αποακετυλασών (Τριχοστατίνη-Α και βαλπροϊκό οξύ), γ. το αντικαρκινικό φάρμακο Ετοποσίδιο και δ. επαγόμενο οξειδωτικό στρες από υπεροξείδιο του υδρογόνου και αρσενικό.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν πειραματικά για πρώτη φορά ότι: 1. ένα VNTR-ελλειμματικό ρετροτρανσποζόνιο SVA είναι ρετρομεταθετικά ενεργό, 2. πολλαπλασιαστικά ενεργά κύτταρα, όπως τα καρκινικά, παρέχουν τις προϋποθέσεις για την τέλεση γεγονότων ρετρομετάθεσης και 3. ένα SVA με υψηλό δυναμικό ρετρομετάθεσης, μπορεί να συμβάλλει στην κακοήθη εξέλιξη της λευχαιμίας.