Απομόνωση αιμοποιητικών και μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον ανθρώπινο πλακούντα χαρακτηρισμός των μεταγραφικών τους προτύπων και σύγκριση αυτών με εκείνα αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από ομφάλιο λώρο

Abstract

The aim of this thesis was the characterization of mesenchymal stem cells isolated from the placenta and comparing the expression profile and their molecular signature with those isolated from the umbilical cord of the same donor using the transcription profile of selected genes. In the study we took samples of umbilical cord blood and placenta from 10 women after birth. Following the exclusion of the hematopoietic stem cells of the umbilical cord blood as well as the placental mesenchymal stem cells, we proceeded to their immunophenotypic determination by the flow cytometric method. Finally, we studied the gene expression of archeogenicity genes of both hematopoietic stem cells of cord blood and placental mesenchymal stem cells of the same donor. In particular, expression of the following genes was tested: CD133, TROP2, CD24, C-KIT, E-CADHERIN. Flow cytometry results showed that hematopoietic stem cells are strongly positive for the CD34 antibody, CD45-positive and antibody-negative in CD44 and CD105, while placental mesenchymal stem cells are negative in CD45 antibodies and are positive for CD105 and CD44 antibodies. At the molecular analysis, the relative expression of the TROP2 and CD24 genes was high and identical in all samples analyzed (hematopoietic stem cells of the umbilical cord blood and mesenchymal placental stem cells). However, expression of the CD133 marker was low and often absent in the majority of the samples in both cell populations. The study showed similarities but also significant phenotypic heterogeneity between the two above-mentioned cell types of characteristics their origin and in particular the hematopoietic proliferative cell progenitor CD34 + / CD45 + for hematopoietic stem cells of umbilical cord blood and of the mesenchymal CD44 +/ CD105 + cell proliferation of mesenchymal placental stem cells. The molecular analysis of these two different populations showed identical expression of stem-cell marker genes (CD24, TROP2) but also heterogeneity associated with the archeogenicity and multiplicity of the hematopoietic stem cells of umbilical cord blood and placental mesenchymal stem cells of the same donor.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να χαρακτηρίσουμε τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που απομονώνονται από τον πλακούντα και να συγκρίνουμε το προφίλ έκφρασής τους και τη μοριακή υπογραφή τους με αυτά που απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο του ιδίου δότη χρησιμοποιώντας το προφίλ μεταγραφής επιλεγμένων γονιδίων. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 10 γυναίκες μετά τον τοκετό ή την Κ.Τ. από τις οποίες λήφθηκαν δείγματα ομφαλιοπλακουντιακού αίματος καθώς και ιστοτεμαχίων πλακούντα. Μετά την εξαίρεση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλιοπλακουντιακού αίματος καθώς και των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων του πλακούντα, προχωρήσαμε σε ανοσοφαινοτυπικό προσδιορισμό αυτών με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Τέλος, μελετήσαμε συγκριτικά τη γονιδιακή έκφραση των γονιδίων αρχεγονικότητας τόσο των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος όσο και των πλακουντιακών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του ιδίου δότη. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε η έκφραση των παρακάτω γονιδίων: CD133, TROP2, CD24, C-KIT, E-CADHERIN. Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα είναι έντονα θετικά στο αντίσωμα CD34, θετικά στο CD45 και αρνητικά στα αντισώματα CD44 και CD105, ενώ αντίθετα τα πλακουντιακά μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα είναι αρνητικά στα αντισώματα CD45 και είναι θετικά στα αντισώματα CD105 και CD44. Κατά τη μοριακή ανάλυση, η σχετική έκφραση των γονιδίων TROP2 και CD24 ήταν υψηλή και ταυτόσημη σε όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν (αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλιοπλακουντιακού αίματος και μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων του πλακούντα). Ωστόσο η έκφραση του δείκτη CD133 ήταν χαμηλή και πολλές φορές απούσα στην πλειονότητα των δειγμάτων, τόσο στους πληθυσμούς των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλιοπλακουντιακού αίματος όσο και των βλαστοκυττάρων του πλακούντα. Τα αποτελέσματα της ερευνητικής μελέτης έδειξαν ομοιότητες αλλά και σημαντική φαινοτυπική ετερόγενεια μεταξύ των δύο προαναφερθέντων κυτταρικών τύπων χαρακτηριστικών της προέλευσής τους και ιδιαίτερα της αιμοποιητικής πολυδύναμης κυτταρικής προβαθμίδας CD34+/CD45+ για τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα του ομφαλιοπλακουντιακού αίματος και της μεσεγχυματικής πολυδύναμης κυτταρικής προβαθμίδας CD44+CD105+ των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του πλακούντα. Η μοριακή ανάλυση αυτών των δύο διαφορετικών πληθυσμών έδειξε ταυτόσημη έκφραση γονιδίων-δεικτών βλαστοκυττάρων (CD24, TROP2) αλλά και ετερογένεια που σχετίζεται με την αρχεγονικότητα και την πολυδυναμία των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων του ομφαλιοπλακουντιακού αίματος και των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του πλακούντα του ιδίου δότη.