Πειραματική μελέτη αντιγονικότητας των προγονικών κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος σε C57BL/6 ποντικούς

Abstract

Research studies focus on the autoimmunity, inflammation and demyelination in the nervous system aiming at developing innovative and more effective treatments. In multifactorial diseases, such as Multiple Sclerosis (MS), immunoregulatory treatments are administered, but treatments that can restore Central Nervous System (CNS) damage are quite limited. Neural Precursor Cells (NPCs) of CNS are under investigation as cell therapy, as they fulfill the characteristics of multipotency, self-renewal and differentiation. Studies of NPCs Transplantation in experimental models of MS, such as Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), demonstrated clinical improvement of animals either by immunomodulation at the periphery or by remyelination through migration to the demyelinating areas. The existing immune disorder may lead to NPCs antigenic epitope recognition and to the production of autoantibodies or immune cells that target NPCs. Thus, the cross-talk between NPCs and the CNS immune mechanisms needs further investigation. The present dissertation focuses on the study of NPCs antigenicity and aims to answer whether their administration in normal mice may provoke immune responses, whether autoantibodies against NPCs niches are produced and whether unidentified NPCs antigenic epitopes are targeted. Initially, we identified the immunophenotype of undifferentiated NPCs isolated from newborn mice C57BL/6, for the expression of CD44, CD24 and CD133, verifying their properties of multipotency, self-renewal, migration and chemotaxis. NPCs were then subcutaneously inoculated to C57BL/6 mice and their effects were studied in comparison with mice injected with MOG, CFA and Νaive controls. The results demonstrated increased expression of genes related to antigen presentation, inflammation and chemotaxis, such as: CD80, CD86, CCL2, CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL10, CXCL12, CXCR2, CXCR4 , IL17RA and TGF-β, in the brain. Additionally, immunohistochemical analysis of inflammatory markers: CD3, MAC-3 and B220, revealed induction of cellular and humoral immunity against NPCs niches, with a remarkable increase of macrophages in the subventricular zone (SVZ). Ten days after immunization, the presence of immune responses in the secondary lymphatic organs was verified by flow cytometry for the expression of CD11b, CD11c, B220, CD3, CD4, CD8, IFN-γ, IL-17, CD25 and FOXP3. Antisera from NPCs or MOG peptide immunized animals were analyzed and immunoreactivity against NPCs was identified. A dominant selective binding of antisera to SVZ of naive mice was observed, throughout the neonatal to adult stage. Antisera from NPCs inoculated animals targeted NPC antigenic epitopes, yielding specific bands on NPCs substrate. Proteomic and bioinformatic analysis of the aforementioned antigenic epitopes revealed over a thousand different set of proteins with at least two of them (protein CAR and CD166) having statistically significant sequence similarity with MOG protein. In vitro analysis of NPCs incubation with antisera showed that an impact on NPCs was exerted through activation of the apoptotic and/or autophagic pathways. In conclusion, the present thesis provided for the first time evidence of antigenic-immunogenic potential of NPCs, cells that are considered immune privileged and are proposed as a potential therapeutic tool for neurodegenerative disorders. The presence of a similar antigenic potential of human NPCs requires thorough investigation, contributing to better understanding of autoimmunity and the tight balance of CNS homeostasis.

Ερευνητικές μελέτες των διαδικασιών αυτοανοσίας, φλεγμονής και απομυελίνωσης στο νευρικό σύστημα στοχεύουν στην ανάπτυξη καινοτόμων αποτελεσματικότερων θεραπειών. Σε πολυπαραγοντικές ασθένειες, όπως η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ), ανοσορυθμιστικές θεραπείες ήδη εφαρμόζονται, αλλά είναι περιορισμένες οι θεραπείες που δύνανται να αποκαταστήσουν τις βλάβες του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) στους ασθενείς. Τα Νευρικά Προγονικά Κύτταρα (ΝΠΚ) του ΚΝΣ αποτελούν αντικείμενο μελέτης ως υποψήφια κυτταρική θεραπεία, καθώς πληρούν χαρακτηριστικά πολυδυναμίας, αυτοανανέωσης και ικανότητας διαφοροποίησης. Η μεταμόσχευσή τους σε πειραματικά μοντέλα προσομοίωσης της ΠΣ, όπως η Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ), έδειξε κλινική βελτίωση των πειραματοζώων είτε μέσω δράσης στην περιφέρεια, είτε επιτελώντας επαναμυελίνωση μέσω μετανάστευσης στις παθολογικές εστίες. Η υπάρχουσα ανοσιακή διαταραχή ενδεχομένως οδηγεί σε αναγνώριση αντιγονικών επιτόπων των ΝΠΚ και σε παραγωγή ειδικών αντισωμάτων ή ανοσιακών κυττάρων έναντι των ΝΠΚ. Η γενικότερη συσχέτισή τους με το ΚΝΣ και με τους ανοσιακούς μηχανισμούς που ενεργοποιούνται χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη μελέτη της αντιγονικότητας των ΝΠΚ, δηλαδή εάν η χορήγησή τους στην περιφέρεια σε φυσιολογικούς μύες δύναται να προκαλέσει ανοσιακή αντίδραση εντός και εκτός του ΚΝΣ, εάν επάγεται παραγωγή αυτοαντισωμάτων έναντι θώκων νευρογένεσης του ΚΝΣ και εάν υπάρχουν άγνωστοι αντιγονικοί επίτοποι των ΝΠΚ που πιθανώς αποτελούν στόχο των αυτοαντισωμάτων. Αρχικά, διενεργήθη χαρακτηρισμός των απομονωμένων ΝΠΚ από εγκεφάλους νεογνών μυών C57BL/6, για έκφραση CD44, CD24 και CD133 και επαληθεύτηκαν οι ιδιότητες πολυδυναμίας, αυτοανανέωσης, μετανάστευσης και χημειοταξίας. Κατόπιν χορηγήθηκαν σε φυσιολογικούς μύες της φυλής C57BL/6 και μελετήθηκε η επίδραση τους, σε σύγκριση με μύες που έλαβαν MOG, CFA και φυσιολογικούς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν αυξημένη έκφραση, κυρίως στον εγκέφαλο, γονιδίων που σχετίζονται με αντιγονοπαρουσίαση, φλεγμονή και χημειοταξία όπως: CD80, CD86, CCL2, CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL10, CXCL12, CXCR2, CXCR4, IL17RA και ΤGF-β. Επιπροσθέτως, η ανοσοϊστοχημική μελέτη δεικτών φλεγμονής: CD3, MAC-3 και B220 φανέρωσε κινητοποίηση κυτταρικής και χυμικής ανοσίας έναντι περιοχών όπου εδράζουν ΝΠΚ, με αξιοσημείωτη την υπέρμετρη αύξηση μακροφάγων κατά τη χρόνια φάση στην υποκοιλιακή ζώνη (SVZ). Η ανάλυση των δευτερογενών λεμφικών οργάνων για έκφραση των δεικτών CD11b, CD11c, B220, CD3, CD4, CD8, IFN-γ, IL-17, CD25 και FOXP3, κατά την 10η ημέρα κατόπιν ανοσοποίησης, επαλήθευσε την κινητοποίηση της ανοσίας. Έπειτα, μελετήθηκαν αντιοροί που προέκυψαν από τα ανοσοποιημένα με ΝΠΚ ή MOG πειραματόζωα και διαπιστώθηκε ανοσοδραστικότητα έναντι ΝΠΚ με εκλεκτικότητα σύνδεσης σε κυτταρικούς πληθυσμούς της SVZ φυσιολογικών μυών τριών διαφορετικών ηλικιών. Οι αντιοροί από τα ανοσοποημένα με ΝΠΚ πειραματόζωα εμφάνισαν επαναληψιμότητα αναγνώρισης πρωτεϊνικών ζωνών σε υπόστρωμα ΝΠΚ, στοχεύοντας συγκεκριμένους αντιγονικούς επιτόπους. Η πρωτεομική και βιοπληροφορική επεξεργασία των παραπάνω πιθανών αντιγονικών επιτόπων, κατέδειξαν πάνω από χίλιες πρωτεΐνες, με τουλάχιστον δύο (πρωτεΐνη CAR και CD166) να εμφανίζουν στατιστικά σημαντικό ποσοστό ομολογίας με τη MOG. Οι αντιοροί μετά από in vitro μελέτη επίδρασης στα ΝΠΚ, ενεργοποίησαν μονοπάτια απόπτωσης ή/και αυτοφαγίας. Συμπερασματικά, η παρούσα ερευνητική προσέγγιση κατέδειξε για πρώτη φορά την πιθανή ύπαρξη αντιγονικού δυναμικού στα ΝΠΚ, κύτταρα τα οποία μέχρι σήμερα θεωρούνται μη ανοσογονικά και έχουν προταθεί ως κυτταρική θεραπεία σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις. Η παρουσία αντίστοιχου αντιγονικού δυναμικού στα ανθρώπινα ΝΠΚ επιβάλλεται να διερευνηθεί για αποσαφήνιση του φαινομένου της αυτοανοσίας και της λεπτής ομοιοστατικής ισορροπίας στο ΚΝΣ.