Μελέτη της δομής και ανάπτυξης ξενιστή και παρασίτου κατά τη διαδικασία επιμόλυνσης φαιοφυκών από ωομύκητες

Abstract

During the last decades, the ecological and commercial interest of the algae has led toincreased scientific research on this group of organisms. Algae are at the basis of most aquaticfood webs, while their photosynthetic activity has impact on global climate. In parallel, globalseaweed production in aquaculture systems has increased exponentially. Nowadays, seaweedsare harvested and cultivated for food, the pharmaceutical industry, and increasingly as apossible biofuel source.Macroalgae, like all other terrestrial and marine organisms, face a constant onslaught frompathogens, including viruses, bacteria and fungi. It has been estimated that the seaweedculture industry sustains losses of annual production between 10 and 30 % as a result ofdiseases caused by pathogens and more specifically, partly by marine oomycetes. This providesa renewed incentive to the study of interactions between algae and these parasites, which hadhitherto been largely ignored.Eurychasma dicksonii is a biotrophic, intracellular marine oomycete, capable to infect atleast 45 species of brown seaweeds in laboratory cultures. The main stages of E. dicksoniiinfection cycle have been described previously and include: zoospore encystment, attachmentof the spore to the host cell wall, penetration of the host cell wall and transfer of the parasite’s protoplast into the host cell, formation of a multinucleate, coenocytic thallus andzoosporogenesis. However, until now, there is no information related to the E. dicksoniiinfection mechanism during the encystment and penetration, the cytoskeleton organization,the cross-talk mechanisms between the parasite and its host and the potential algal defensiveresponses against the oomycete.The present doctoral thesis aimed to present new findings on the cytoskeletonorganization of both host and parasite, cover the gaps of knowledge on the E. dicksoniiinfection mechanism and shed light onto the potential host-parasite interactions and hostdefenses. The most important observations of the present study are summarized below: 1. Ultrastructural study of E. dicksonii attachment and penetration mechanismThe present part of the doctoral thesis focuses on the mechanism used by the pathogen toattach on the host cell wall and force its way into algal cells. Ultrastructural examinationrevealed a needle-like structure, which develops within the attached spore and extends alongits main axis. Particular cell wall modifications are present at the basal part of the spore(adhesorium pad) and guide the needle-like tool to penetrate perpendicularly the host cell wall.The injection mechanism is shared with Haptoglossa sp. which suggests that this is animportant characteristic of early diverging oomycetes. Furthermore, the encystment andadhesion mechanism of E. dicksonii shows significant similarities with other oomycetes, someof which are plant pathogens.2. Cytoskeleton plays a key role in the algal defense and in E. dicksonii differentdevelopmental stagesImmunofluorescence imaging of tubulin revealed how the development of the intracellularbiotrophic pathogen E. dicksonii impacts on microtubule (MT) organization of three brown algalspecies, Pylaiella littoralis, Ectocarpus siliculosus, and Ectocarpus crouaniorum. The host MT cytoskeleton remains normal and organized by the centrosome until the very late stages of theinfection. Additionally, the organization of the parasite’s cytoskeleton was examined. Duringmitosis of the E. dicksonii nucleus, the MT focal point (microtubule organization centre, MTOC,putative centrosome) duplicates and each daughter MTOC migrates to opposite poles of thenucleus. Moreover, actin labeling with rhodamine-phalloidin in E. dicksonii revealed typicalimages of actin dots connected by fine actin filament bundles in the cortical cytoplasm.3. Host response to infection with β-1,3-glucan deposition on the host cell wallStaining and immunolabeling techniques showed the deposition of β-1,3-glucans on the hostcell wall at the pathogen penetration site, a strategy similar to physical responses previouslydescribed only in infected plant cells. It is assumed that the host defense in terms of callose-likedeposition is an ancient response to infection. 4. Cell wall component analysis sheds light on the crosstalk between filamentous brownalgae and E. dicksoniiIn order to gain insight in the composition and plasticity of the algal and pathogen cell wallsduring infection, twelve host strains from four orders of Phaeophyceae (Ectocarpales,Laminariales, Discosporangiales, Tilopteridiales) and their pathogen E. dicksonii, were scannedby ten antibodies targeted at different cell wall components. The results revealed that there areno modifications occurred on the host cell wall, apart from the β-1,3 glucan deposition at thepenetration site. Additionally, it was found that sulfated fucans exist on the E. dicksonii cellwall, which is a novel finding for oomycetes.5. Incubation of infected material with medium including monosaccharides andhormonesIncubation of material infected by E.dicksonii with D-galactose and L-fucose during a complete,14-day infection cycle, showed significant decrease of pathogenicity. It is assumed that, due tothe long incubation with monosaccharides, host defensive strategies are triggered. In addition,incubation of infected algae with salicylic acid revealed significant decrease of the infections and increase of the algal hypersensitive response. Salicylic acid is known to play an importantrole in the defensive biochemical pathways of plants against oomycetes.

Τα φύκη συγκεντρώνουν μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον κατά τις τελευταίες δεκαετίες,λόγω του οικολογικού αλλά και του οικονομικού ενδιαφέροντος που παρουσιάζουν. Οι φωτοσυνθετικοί αυτοί οργανισμοί αποτελούν τους βασικούς παραγωγούς των θαλάσσιων οικοσυστημάτων, βρίσκονται στη βάση όλων σχεδόν των θαλάσσιων τροφικών αλυσίδων και παίζουν πρωταρχικό ρόλο στην παγκόσμια κλιματική αλλαγή. Ακόμη, από τη δεκαετία του ‘80 έως σήμερα τα ποσοστά παγκόσμιας καλλιέργειας φυκών αυξάνονται εκθετικά, ενώ το επενδυτικό ενδιαφέρον στρέφεται στη χρήση τους ως τροφή από τον άνθρωπο ή άλλα καλλιεργούμενα είδη (πχ. γαστερόποδα, ψάρια), βιοκαύσιμη ύλη και φαρμακευτικά προϊόντα.Τα μακροφύκη, όπως όλοι οι χερσαίοι και θαλάσσιοι οργανισμοί, μολύνονται από μικροοργανισμούς συμπεριλαμβανομένων των ιών, των βακτηρίων και των μυκήτων. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί προσβάλλουν τους πληθυσμούς φυκών προκαλώντας σημαντικές καταστροφές στο πεδίο αλλά και στις μονάδες εντατικής καλλιέργειας. Πιο συγκεκριμένα, οι καλλιεργητές αντιμετωπίζουν 10-30% μείωση της ετήσιας παραγωγής λόγω επιδημιών που προκαλούνται από θαλάσσιους παθογόνους μικροοργανισμούς και κυρίως από τους θαλάσσιους ωομύκητες. Τα ως τώρα αποσπασματικά μελετημένα θαλάσσια παράσιτα αποκτούν εμπορική σημασία ανάλογη των χερσαίων ομολόγων τους, ενώ απαραίτητη κρίνεται η μελέτη των αλληλεπιδράσεών τους με τα φύκη-ξενιστές.Το είδος Eurychasma dicksonii είναι ενας ολοκαρπικός υποχρεωτικά ενδοπαρασιτικός θαλάσσιος ωομύκητας, ο οποίος προσβάλλει τουλάχιστον 45 είδη φαιοφυκών. Τα βασικά στάδια της μόλυνσης φαιοφυκών από τον E. dicksonii έχουν μελετηθεί και περιλαμβάνουν:εγκύστωση του ζωοσπορίου του ωομύκητα, προσκόλληση του σπορίου στο κυτταρικό τοίχωμα του ξενιστή, διάτρηση του κυτταρικού τοιχώματος και μεταφορά μέρους του πρωτοπλάστη στο εσωτερικό του ξενιστή, δημιουργία κοινοκυτικού πολυπύρηνου θαλλού και ζωοσποριογένεση. Ωστόσο, ως τώρα δεν υπάρχουν πληροφορίες για τον μηχανισμό της εγκύστωσης και διείσδυσης του παράσιτου στο εσωτερικό του κυττάρου-ξενιστή, την οργάνωση του κυτταροσκελετού, τους μηχανισμούς αναγνώρισης ξενιστή-παθογόνου, τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις και πιθανούς αμυντικούς μηχανισμούς του ξενιστή έναντι του παράσιτου. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο τη λεπτομερή ανάλυση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού τόσο του ξενιστή όσο και του παράσιτου, την απόκτηση επιπλέον γνώσεων που θα συμπληρώσουν τις ήδη υπάρχουσες πληροφορίες για τον μηχανισμό μόλυνσης, τις πιθανές αντιδράσεις των μελετώμενων ειδών φαιοφυκών έναντι της μόλυνσης από το Ε. dicksonii και λοιπούς μηχανισμούς αλληλεπιδράσεων ξενιστή-παράσιτου. Τα κυριότερα ευρήματα της διατριβής περιγράφονται συνοπτικά παρακάτω:1. Μελέτη της λεπτής δομής αποκαλύπτει τον μηχανισμό προσκόλλησης και διείσδυσης του E. dicksonii στον ξενιστή.Μελέτη με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης και σάρωσης των επιμέρους σταδίων της προσκόλλησης και διείσδυσης αποκάλυψε ότι το σπόριο του E. dicksonii διαφοροποιείται κατά τα αρχικά στάδια της προσβολής. Το ζωοσπόριο εγκυστώνεται, δηλαδή σχηματίζει κυτταρικό τοίχωμα (ΚΤ) και μετασχηματίζεται σε ακίνητο σπόριο. Το σπόριο προσκολλάται στο ΚΤ του ξενιστή. Αμέσως μετά την επαφή με τον ξενιστή, το σπόριο εκκρίνει ένα ινώδες,προσκολλητικό υλικό με το οποίο φαίνεται να συνδέεται με την επιφάνεια του ξενιστή. Σ’ αυτό το στάδιο, ο πρωτοπλάστης του σπορίου περιέχει έναν ευμεγέθη πυρήνα που γειτνιάζει με μια ομάδα μιτοχονδρίων. Στο κορυφαίο τμήμα του κυτοπλάσματος, στην αντίθετη πλευρά από τη βάση του σπορίου, κυριαρχούν κυστίδια με ηλεκτρονιόπυκνο υλικό και δικτυοσωμάτια.Η λεπτομερής μελέτη της λεπτής δομής απoκάλυψε την ύπαρξη ενός ηλεκτρονιόπυκνου βελονοειδούς σχηματισμού (400 nm πλάτος, 4 μm μήκος), που εκτείνεται παράλληλα με τον επιμήκη άξονα του σπορίου και διασχίζει όλο το μήκος του. Ο σχηματισμός αυτός περιβάλλεται από ηλεκτρονικά διαφανές τοιχωματικό υλικό και εφάπτεται με το αρχικά αδιαφοροποίητο ΚΤ, που βρίσκεται στο κάτω μέρος του σπορίου και ονομάζεται πλάκα προσκόλλησης (adhesorium pad). Τα μικρά κυστίδια της κορυφαίας περιοχής συντήκονται και σχηματίζουν ένα ευμέγεθες χυμοτόπιο. Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιείται η διαφοροποίηση του ΚΤ της πλάκας προσκόλλησης του σπορίου, με κεντρομόλο εναπόθεση τοιχωματικού υλικού προς το εσωτερικό του σπορίου. Οι τοιχωματικές προεκβολές διαμερισματοποιούν το σπόριο, αφήνοντας μια ανοιχτή οπή. Παρατήρηση σειράς τομών της βελονοειδούς δομής έδειξε ότι αυτή διέρχεται μέσω της ανοιχτής οπής και εκτοξεύεται έξω από το σπόριο με κατεύθυνση προς το ΚΤ του ξενιστή, το οποίο ακολούθως διαρρηγνύει.2. Η οργάνωση του κυτταροσκελετού εμπλέκεται στην αμυντική απόκριση του ξενιστή και στα βασικά αναπτυξιακά στάδια του E. dicksonii.Η ανοσοσήμανση της σωληνίνης στα μολυσμένα από τον Ε. dicksonii φαιοφύκη Pylaiellalittoralis, Ectocarpus siliculosus και Ectocarpus crouaniorum έδειξαν ότι οι μικροσωληνίσκοι του ξενιστή παραμένουν φυσιολογικά οργανωμένοι γύρω από το κεντροσωμάτιο, ακόμη και σε προχωρημένα στάδια της μόλυνσης. Πιο συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι παρ’ ότι η μόλυνση από τον ωομύκητα οδηγεί σε σταδιακή αποδιοργάνωση των οργανιδίων του κυτοπλάσματος του ξενιστή, η οργάνωση των μικροσωληνίσκων παραμένει φυσιολογική μέχρι και τα αρχικά στάδια δημιουργίας του ζωοσποριάγγειου του ωομύκητα, οπότε και διαταράσσεται.Παράλληλα, μελετήθηκε η οργάνωση του κυτταροσκελετού του E. dicksonii. Η ανοσοσήμανση σωληνίνης αποκάλυψε την παρουσία ενός κέντρου σύγκλισης των μικροσωληνίσκων πλησίον του πυρήνα του παράσιτου, το οποίο πιθανόν αντιπροσωπεύει ένα κέντρο οργάνωσης μικροσωληνίσκων (ΚΟΜ). Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης διαπιστώθηκε ότι το ΚΟΜ αποτελείται από δυο κινητοσώματα. Κατά τη μίτωση, το ΚΟΜ διπλασιάζεται και κάθε ένα από τα δύο θυγατρικά ΚΟΜ μεταναστεύει στους δύο αντίθετους πόλους του πυρήνα. Στο στάδιο της δημιουργίας του ζωοσποριάγγειου παρατηρούνται, ανάλογα με το μέγεθος της δομής, 4 ή5 ΚΟΜ και δέσμες μικροσωληνίσκων διασχίζουν όλη την έκταση του ζωοσποριάγγειου. Στο ώριμο ζωοσποριάγγειο εντοπίζονται περιφερειακά διατεταγμένα σπόρια, από τα οποία απελευθερώνονται τα ζωοσπόρια του ωομύκητα. Σε αυτό το στάδιο, οι μικροσωληνίσκοι συμμετέχουν στη δημιουργία των μαστιγίων τα οποία εκτείνονται από τα κινητοσώματα. Χρώση της ακτίνης με ροδαμίνη-φαλλοϊδίνη έδειξε οτι, στα σπόρια του ωομύκητα, ο κυτταροσκελετός της ακτίνης έχει τη μορφή πλακών και συμπαγών δεσμίδων μικρονηματίων ακτίνης (ΜΑ). Αρχικά, στα πρώτα στάδια της μόλυνσης, κάθε πυρήνας συνοδεύεται από πλάκες συμπαγούς ακτίνης και δεσμίδες ΜΑ. Σε επόμενο στάδιο, με την έναρξη της δημιουργίας του ζωοσποριάγγειου, εντοπίζονται κυρίως διάχυτα ΜΑ και παρατηρείται μειωμένος αριθμός πλακών συμπαγούς ακτίνης. 3. Απόκριση του ξενιστή έναντι του παράσιτου με εναπόθεση β-1, 3 γλυκάνης στο σημείο προσκόλλησης του σπορίου του ωομύκητα. Μελέτη της λεπτής δομής έδειξε τη διατάραξη της δομής και της σύστασης του ΚΤ του ξενιστή στη θέση εισόδου του παράσιτου. Διαπιστώθηκε εναπόθεση άμορφου υλικού υπό μορφή θηλής (papilla), το οποίο σημαίνεται με το αντίσωμα έναντι της β-1,3 γλυκάνης και είναι θετικό σε χρώση με κυανούν της ανιλίνης. Εικάζεται ότι η ενίσχυση του ΚΤ του ξενιστή στο σημείο της προσβολής αποτελεί αμυντική απόκριση του φύκους και συνδέεται με μηχανισμούς αναγνώρισης του E. dicksonii.4. Aνάλυση των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος ξενιστή και παράσιτου:εντοπισμός θειωμένης φουκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα του Ε. dicksonii.Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι διαφορετικών συστατικών του ΚΤ των φαιοφυκών και του ωομύκητα, προκειμένου να διαπιστωθεί η πιθανή συμμετοχή των υδατανθράκων σε μηχανισμούς αναγνώρισης ξενιστή-παράσιτου.Χρησιμοποιήθηκαν 12 κλώνοι φαιοφυκών, οι οποίοι μολύνονται από τον E. dicksonii. Στο μολυσμένο πειραματικό υλικό δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στη σύσταση του ΚΤ. Η μόνη μεταβολή που παρατηρήθηκε και στους 12 κλώνους φαιοφυκών, είναι η εναπόθεση β-1,3 γλυκάνης στο σημείο της μόλυνσης, ως αντίδραση έναντι της προσβολής από τον ωομύκητα. Σε ότι αφορά στο ΚΤ του E. dicksonii, παρατηρήθηκε για πρώτη φορά θετική αντίδραση μετά από χρήση αντισώματος έναντι της θειϊκής φουκάνης.5. Επίδραση υδατανθράκων και ορμονών στην μόλυνση φαιοφυκών από το E. dicksonii.Μολυσμένοι θαλλοί φαιοφυκών επωάστηκαν με μέσο καλλιέργειας που περιείχε επιλεγμένους μονοσακχαρίτες (D- γαλακτόζη, L- φουκόζη, D- γλυκόζη, D- μαννόζη, N-ακετυλ-D-γαλακτοζαμίνη, Ν-ακετυλ-D-γλυκοσαμίνη, D- φρουκτόζη). Το υλικό παρατηρήθηκε σε οπτικό μικροσκόπιο μετά το πέρας 14 ημερών, το διάστημα που απαιτείται για να ολοκληρωθεί ένας κύκλος μόλυνσης. Παρατηρήθηκε μείωση των μολύνσεων του E. dicksonii στην περίπτωση τηςD-γαλακτόζης και της L-φουκόζης, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή συμμετοχή των δύο μονοσακχαριτών στους μηχανισμούς αναγνώρισης του παράσιτου από τον ξενιστή και της ενεργοποίησης αμυντικών μηχανισμών. Ακόμη, επώαση μολυσμένων θαλλών με μέσο καλλιέργειας που περιέχει σαλικυλικό οξύ προκαλεί ανάσχεση της μόλυνσης και αύξηση της υπερευαίσθητης απόκρισης του ξενιστή.Συμπερασματικά, τα δεδομένα της παρούσας διατριβής αποκάλυψαν για πρώτη φορά το ρόλο του κυτταροσκελετού, τόσο στην αντίσταση του ξενιστή έναντι της μόλυνσης όσο και στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του παράσιτου. Ακόμη, περιγράφηκε λεπτομερώς σε επίπεδο λεπτής δομής ο μηχανισμός προσκόλλησης και διείσδυσης του E. dicksonii στο κύτταρο του φύκους, αποδεικνύοντας έτσι την ύπαρξη κοινών μηχανισμών μόλυνσης μεταξύ των αντιπροσώπων της ομάδας των ωομυκήτων, αλλά και μοναδικά χαρακτηριστικά της μορφολογίας του εν λόγω παράσιτου. Επιπρόσθετα, η εναπόθεση β-1,3 γλυκανών στοκυτταρικό τοίχωμα του ξενιστή αποτελεί γνωστή αμυντική απόκριση των φυτών έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών και αναφέρεται για πρώτη φορά και στα φαιοφύκη. Επιπλέον,πραγματοποιήθηκε ανάλυση των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος ξενιστή και παράσιτου, η οποία συμβάλλει, όπως είναι γνωστό και από άλλα συστήματα, στην κατανόηση πιθανών μηχανισμών αναγνώρισης. Διαπιστώθηκε, μεταξύ άλλων, η ύπαρξη θειϊκής φουκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα του E. dicksonii, εύρημα το οποίο αναφέρεται για πρώτη φορά στους ωομύκητες. Τέλος, παρατηρήθηκε οτι οι μονοσακχαρίτες D-γαλακτόζη, L-φουκόζη αλλά και το σαλικυλικό οξύ πιθανόν να συμμετέχουν σε μονοπάτια αναγνώρισης του παράσιτου από τονξενιστή και άμυνας των φαιοφυκών έναντι στην προσβολή από τον E. dicksonii.