A role of RGS proteins in opiate actions

Abstract

Opioids are among the most effective medications used for the alleviation of severe pain conditions, but their long-term use is hindered by the development of analgesic tolerance, dependence and addiction. Understanding the molecular mechanisms underlying their analgesic effects and the adaptations leading to the development of the undesirable side-effects would be a significant contribution towards improving chronic pain treatment. Falling within this rational, the present thesis focused on examining the role of regulator of G-protein signaling (RGS) proteins in opiate actions. RGS proteins possess a wide and diverse family of proteins known to mediate G-protein coupled receptor (GPCR) signaling duration and direction, through their interaction with heterotrimeric Gα subunits. Here, we study the role of two RGS family members that modulate Mu opioid receptor (MOPR) mediated signaling, RGS9-2 and RGSz1. Particularly, the thesis is consisting of three specific aims:Aim I examined if and how RGS9-2 modulates responses to oxycodone both in pain-free conditions and under chronic pain states. RGS9-2 is predominantly expressed in the striatum and it has been shown to exert a critical role on the MOPR signaling. It is a negative regulator of morphine analgesia and reward, while at the same time it promotes the development of morphine tolerance. In contrast, RGS9-2 appears as a positive modulator of other MOPR agonist, such as methadone and fentanyl. Here we investigate its role as a regulator of another MOPR agonist widely used and abused over the last years, oxycodone. Using transgenic mice lacking the Rgs9 gene (RGS9KO), we observed that RGS9-2 positively regulates the rewarding effects of oxycodone both in pain-free states and in a model of neuropathic pain. Furthermore, although RGS9-2 does not affect the acute analgesic efficacy of the drug, it opposes the development of oxycodone tolerance. Overall, these results provide new information on the signal transduction mechanisms underlying the analgesic and rewarding actions of oxycodone.Aim II is focused on the role of RGSz1 in opiate actions. RGSz1 is a small RGS protein primarily expressed in brain tissue, that exhibits high specificity for Gαz subunits and has been shown to act downstream of MOPR and serotonin receptor 1A (Htr1A). Using genetic mouse models for constitutive or conditional/brain region-targeted manipulations of RGSz1 expression, we demonstrated that the analgesic efficacy of several MOPR agonists is increased by preventing RGSz1 actions both in male and female mice. In addition, prevention of RGSz1 action delays the development of morphine tolerance while decreasing the sensitivity to rewarding and locomotor activating effects. Using next-generation RNA sequencing combined with further biochemical12assays examining protein expression and localization, we identified a key role of RGSz1 in the periaqueductal gray (PAG) in morphine tolerance. We show that chronic morphine administration promotes RGSz1 activity in the PAG, which in turn modulates transcription mediated by the Wnt/β-catenin signaling pathway and promotes analgesic tolerance to morphine. Conversely, prevention of RGSz1 action stabilizes Axin2-Gαz complexes near the membrane, promoting β-catenin activation, thereby delaying the development of analgesic tolerance. These data highlight that regulation of RGS complexes, particularly those involving RGSz1-Gαz, represent a promising target for optimizing the analgesic actions of opioids without increasing the risk of dependence or addiction.Finally, aim III examined the role of RGSz1 in behavioral and biochemical adaptations to chronic pain. Using well established murine pain models, we show that deletion of the Rgsz1 gene, as well as conditional knockdown of RGSz1 in the mouse PAG, lead to prolonged sensitized behaviors only in female mice undergoing inflammatory or neuropathic pain. In addition, by combining standard molecular biology techniques (RT-PCR, Western Blot) with next-generation RNA sequencing we showed that chronic inflammatory pain-like states promote a number of unique adaptations in the female PAG, including changes in the expression of molecules involved in serotonin synthesis and release. Further upstream regulator analysis, together with behavioral and biochemical data, revealed the involvement of estrogen receptor mediated signaling in nociceptive hypersensitivity. These findings provide insight to the sex-specific intracellular mechanisms underlying nociceptive responses under chronic pain conditions, and point to RGSz1-regulated pathways as promising targets for the treatment of chronic pain.

Τα οποιοειδή αναλγητικά φάρμακα αποτελούν μια από τις πιο αποτελεσματικές θεραπείες σε περιπτώσεις οξέος πόνου, αλλά η χρόνια χρήση τους αντενδείκνυται λόγω της ανάπτυξης αναλγητικής αντοχής καθώς και φαινομένων εξάρτησης και εθισμού. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται τόσο για τις αναλγητικές τους ιδιότητες, όσο και για την εμφάνιση των ανεπιθύμητων παρενεργειών, θα αποτελούσε σημαντική συνεισφορά στην βελτίωση της θεραπείας κατά του χρόνιου πόνου. Υπό αυτό το πρίσμα, σκοπό της εν λόγω διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των RGS πρωτεϊνών (ρυθμιστές της σηματοδότησης μέσω G πρωτεϊνών) στις δράσεις των οποιοειδών. Οι RGS πρωτεΐνες αποτελούν κύριο ρυθμιστή της σηματοδότησης μέσω υποδοχέων συνδεδεμένων με G-πρωτεΐνες (GPCR), επηρεάζοντας τόσο την διάρκεια όσο και την κατεύθυνση της σηματοδότησης δια της αλληλεπίδρασής τους με τις ετεροτριμερείς Gα υπομονάδες. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε σε δύο μέλη της RGS οικογένειας, που εμπλέκονται στην σηματοδότηση μέσω του μ υποδοχέα των οποιοειδών (MOPR), την RGS9-2 και την RGSz1. Συγκεκριμένα, η διατριβή αποτελείται από τρείς επιμέρους ερευνητικούς σκοπούς:Πρώτο σκοπό αποτέλεσε η μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης RGS9-2 στις δράσεις της οξυκωδόνης με ή χωρίς την παρουσία χρόνιου πόνου. Η πρωτεΐνη RGS9-2 εκφράζεται κατά βάση στην περιοχή του ραβδωτού και είναι γνωστή η σημαντικότατη δράση της στην σηματοδότηση μέσω του MOPR. Αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή τόσο των αναλγητικών όσο και των ανταμοιβικών δράσεων της μορφίνης, ενώ παράλληλα συμβάλλει στην ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Αντιθέτως, φέρεται ως θετικός ρυθμιστής άλλων αγωνιστών του MOPR, όπως η μεθαδόνη και η φαιντανύλη. Εν προκειμένω διερευνήθηκε ο ρόλος της στις δράσης ενός ακόμη αγωνιστή του MOPR, ο οποίος παρουσιάζει εκθετικά αυξανόμενη χρήση καθώς και κατάχρηση τα τελευταία χρόνια, της οξυκωδόνης. Χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη του Rgs9 γονιδίου (RGS9KO), παρατηρήθηκε ότι η RGS9-2 συμβάλλει στην εγκαθίδρυση των ανταμοιβικών δράσεων της οξυκωδόνης σε υγιή ζώα καθώς και σε ζώα που έχουν υποβληθεί σε μοντέλο χρόνιου νευροπαθητικού πόνου. Επιπλέον, ενώ η RGS9-2 δεν επηρεάζει τις άμεσες αναλγητικές δράσεις του φαρμάκου, παρεμποδίζει την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Σε γενικές γραμμές, τα ανωτέρω αναφερόμενα αποτελέσματα παρέχουν νέες πληροφορίες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν τις αναλγητικές και ανταμοιβικές δράσεις της οξυκωδόνης.Ο δεύτερος ερευνητικός στόχος της διατριβής αφορά τον ρόλο της RGSz1 στις δράσεις των οποιοειδών. Η RGSz1 είναι μια μικρή RGS πρωτεΐνη, εκφραζόμενη κατά κύριο λόγο στον εγκέφαλο, η οποία εμφανίζει ιδιαίτερα υψηλή ειδικότητα για τις Gαz υπομονάδες και φέρεται να10εμπλέκεται στην ρύθμιση του MOPR καθώς και του υποδοχέα σεροτονίνης 1Α (Htr1A). Με την χρήση γενετικά τροποποιημένων ποντικών με ολική ή μερική καταστολή έκφρασης της RGSz1, παρατηρήθηκε ότι οι αναλγητικές ιδιότητες διαφόρων αγωνιστών του MOPR αυξάνονται έπειτα από παρεμπόδιση της δράσης της πρωτεΐνης τόσο σε αρσενικά όσο και σε θηλυκά ποντίκια. Επιπλέον, σημειώθηκε καθυστέρηση στην ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής στη μορφίνη, με ταυτόχρονη μείωση των ανταμοιβικών δράσεων του φαρμάκου. Πειράματα αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing), σε συνδυασμό με βιοχημικά πειράματα προσδιορισμού επιπέδων έκφρασης καθώς και υποκυττάριου εντοπισμού πρωτεϊνών, ανέδειξαν τον μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου η RGSz1 στην περιϋδραγωγό φαιά ουσία (PAG) επηρεάζει την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής στην μορφίνη. Παρατηρήθηκε ότι η επανειλημμένη χορήγηση μορφίνης ενισχύει τη δράση της RGSz1 στο PAG, η οποία με τη σειρά της συμβάλλει στην καταστολή της σηματοδότησης μέσω του μονοπατιού Wnt/β-catenin προάγοντας την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Αντιστρόφως, παρεμπόδιση της δράσης της RGSz1 έχει ως αποτέλεσμα την διατήρηση σταθερότερων συμπλόκων Axin2-Gαz κοντά στην πλασματική μεμβράνη, γεγονός που οδηγεί σε ενεργοποίηση της β-catenin και αναστολή ανάπτυξης αναλγητικής ανοχής. Συνοψίζοντας, τα εν λόγω δεδομένα υποδεικνύουν την σημαντικότητα της στόχευσης των αλληλεπιδράσεων των RGS πρωτεϊνών, και συγκεκριμένα του συμπλόκου RGSz1-Gαz, για την βελτίωση της αναλγητικής δράσης των οποιοειδών χωρίς αύξηση της πιθανότητας ανάπτυξης εθισμού.Τέλος, ο τρίτος ερευνητικός σκοπός της μελέτης επικεντρώθηκε στον ρόλο της RGSz1, τόσο στις συμπεριφορικές αποκρίσεις όσο και στις βιοχημικές προσαρμογές, σε ζωικά μοντέλα χρόνιου πόνου. Χρησιμοποιώντας ευρέως εδραιωμένα ζωικά μοντέλα χρόνιου πόνου, παρατηρήθηκε ότι αναστολή έκφρασης της RGSz1 στο PAG θηλυκών ποντικών, οδηγεί σε παρατεταμένες αλγαισθητικές αποκρίσεις σε περιπτώσεις φλεγμονώδους ή νευροπαθητικού πόνου. Επιπλέον, συνδυάζοντας βασικές τεχνικές μοριακής βιολογίας (Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, ανοσοαποτύπωση) με πειράματα αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing) διαπιστώθηκε ότι υπό καταστάσεις χρόνιου φλεγμονώδους πόνου επάγονται μοναδικές μεταγραφικές αλλαγές στο PAG των θηλυκών ποντικών, συμπεριλαμβανομένων αλλαγών στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με παραγωγή και απελευθέρωση σεροτονίνης. Περεταίρω ανάλυση ανέδειξε ως ανώτερο ρυθμιστή των επαγόμενων προσαρμογών την σηματοδότηση μέσω του α-υποδοχέα των ιστογόνων (ERα). Τα ανωτέρω αποτελέσματα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τους φυλο-εξαρτώμενους ενδοκυττάριους μηχανισμούς που διέπουν τις αλγαισθητικές αποκρίσεις, τονίζοντας επιπλέον την χρησιμότητα της RGSz1 ως φαρμακευτικού στόχου για περιπτώσεις χρόνιου πόνου.