Μελέτη των χαρακτηριστικών της αθηρωματικής στένωσης των καρωτίδων σε σταθερές και ασταθείς πλάκες και συσχέτιση με ειδικούς ανοσοϊστοχημικούς δείκτες σε ιστολογικά παρασκευάσματα

Abstract

Purpose: Carotid atherosclerosis represents a primary cause for cerebrovascular ischemic events and its contemporary management includes surgical revascularization for moderate to severe symptomatic stenoses. Intraplaque neovascularization and vasa vasorum (VV) proliferation contribute to the progression and rupture of atherosclerotic lesions. Contrast Enhanced Ultrasonography (CEUS) of the carotid artery is a relatively novel diagnostic tool that exploits resonated ultrasound waves from circulating microbubbles and has been reported to attain data regarding intraplaque neovessels and VV. However, whether the detection of microbubbles by CEUS within atherosclerotic plaques truly represents microvessels is a point of concern. We aimed to evaluate stable and unstable carotid artery plaque VV pattern by CEUS and its correlation with histology and immunochemistry.Patients and methods: Patients either symptomatic or with know cardiovascular risk factors and carotid artery plaques scheduled for plaque endarterectomy were enrolled in this study. Carotid artery plaques were initially identified by conventional ultrasonography and subsequently CEUS (harmonic ultrasound imaging with simultaneous intravenous contrast agent injection) was performed. The recorded image loops were evaluated by a semi-automated method with region of interest brightness determination and image post-processing. Following carotid endarterectomy, plaque specimens were classified as either fibroatheromas (class V) or complicated atherosclerotic plaques (class VI) and underwent histological and immunochemical analysis. Immunochemistry was performed with VEGF antibodies (for neovessel staining) and CD3, CD34 and CD68 antibodies to identify inflammatory and endothelial cells. Using optical microscopy (x200) the number of microvessels per optical field was determined, while their quantification took place with specialised software.Results: Twenty one patients (67.6 ± 10.2 years, 16 males) with a 86.9 ± 11.5 % degree of carotid artery stenosis were evaluated. Histology showed that 11 plaques were class VI or complicated and 10 plaques were fibroatheromas. Enhancement of plaque and lumen brightness on CEUS was significantly increased following contrast administration (p = 0.001, for both). Furthermore, plaque brightness showed a significant increase for both stable and unstable plaque subgroups (p=0.018, for both). Immunochemistry showed that microvessels, as assessed by CD34 antibody, were more dense in unstable (class VI) vs. stable plaques (class V) (36.6 ± 17.4 vs. 13.0 ± 7.2 respectively, p = 0.002). In addition, expression of VEGF and CD68 antibodies was higher for unstable plaques (p=0.021), while expression of CD3 antibody was comparable between the two plaque categories (p=0.103). Correlation between plaque-to-lumen brightness enhancement on CEUS, microvessel density and the local presence of inflammatory cells was significant only for stable plaques, as assessed with CD34 (r=0.800, p=0.031) and CD68 (r=0.791, p=0.034) antibody staining.Conclusions: While plaque microvessels as identified with histology and immunochemistry were more dense in complicated class VI carotid atheromas, plaque enhancement during CEUS was more intense in stable class V plaques. Furthermore, plaque enhancement with microbubbles closely correlated with the density of plaque neovessels in stable lesions but not in unstable ones. This lack of correlation in class VI plaques indicates that microbubble entry into unstable lesions might take place through routes other than the plaque neovasculature, such as plaque fissures.

Σκοπός: Η καρωτιδική αθηροσκλήρυνση αποτελεί βασική αιτία ισχαιμικών εγκεφαλικών επεισοδίων και η σύγχρονη αντιμετώπισή της περιλαμβάνει τη χειρουργική επαναγγείωση για τις μέτρια και σοβαρές συμπτωματικές στενωτικές βλάβες. Η νεοαγγείωση της αθηρωματικής πλάκας και ο πολλαπλασιασμός των τριχοειδών του έξω χιτώνα του αγγειακού τοιχώματος συμβάλλουν στην πρόοδο και τη ρήξη των αθηροσκληρυντικών βλαβών. Η υπερηχογραφία της καρωτίδας με σκιαγραφικό μέσο αποτελεί μία σχετικά νέα διαγνωστική μέθοδο, η οποία εκμεταλλεύεται την ανάκλαση των υπερηχογραφικών κυμάτων από τις κυκλοφορούσες μικροφυσαλλίδες, ενώ έχει αναφερθεί ότι τα ευρήματά της σχετίζονται με τη νεοαγγείωση της αθηρωματικής πλάκας. Παρόλ’αυτά, κατά πόσο η ανίχνευση των μικροφυσαλλίδων με την υπερηχογραφία ανταποκρίνεται αληθώς στα νεοαγγεία της πλάκας αποτελεί αντικείμενο συζήτησης. Η παρούσα μελέτη στοχεύει στην εκτίμηση των νεοαγγείων σταθερών και ασταθών καρωτιδικών βλαβών με την εφαρμογή υπερηχογραφίας με σκιαγραφικό και στη συσχέτιση των ευρημάτων της με ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά δεδομένα.Ασθενείς και μέθοδοι: Στη μελέτη αυτή συμπεριλήφθηκαν ασθενείς συμπτωματικοί ή με γνωστούς καρδιαγγειακούς παράγοντες κινδύνου και καρωτιδικές αθηρωματικές πλάκες οι οποίοι προγραμματίζονταν για καρωτιδική ενδαρτηρεκτομή. Οι καρωτιδικές πλάκες αρχικά αναγνωρίσθηκαν κατά τον έλεγχο με συμβατική δισδιάστατη υπερηχογραφία και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε υπερηχογραφία με σκιαγραφικό μέσο. Οι καταγεγραμμένες εικόνες εκτιμήθηκαν με τη χρήση μίας ημιαυτοματοποιημένης μεθόδου, καθορισμό της φωτεινότητας προκαθορισμένων περιοχών ενδιαφέροντος και αναδρομική ανάλυση. Μετά την καρωτιδική ενδαρτηρεκτομή, τα παρασκευάσματα των αθηρωματικών πλακών ταξινομήθηκαν είτε ως ινοαθηρώματα (ταξης V), είτε ως επιπλεγμένες πλάκες (τάξης VI) και υπεβλήθησαν σε ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε με αντισώματα έναντι του VEGF (για τη χρώση νεοαγγείων) και έναντι των CD3, CD34 και CD68 για την αναγνώριση φλεγμονωδών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Με τη χρήση οπτικού μικροσκοπίου (x200) καθορίσθηκε ο αριθμός των νεοαγγείων κατ’οπτικό πεδίο, ενώ η ποσοτικοποίησή τους πραγματοποιήθηκε με εξειδικευμένο λογισμικό.Αποτελέσματα: Εκτιμήθηκαν είκοσι ένας ασθενείς (67,6 ± 10,2 έτη, 16 άνδρες) με μέσο βαθμό καρωτιδικής στένωσης 86,9 ± 11,5%. Η ιστολογική ανάλυση ανέδειξε ότι 11 πλάκες ήταν τάξης VI ή επιπλεγμένες και 10 ήταν ινοαθηρώματα. Η φωτεινότητα της αθηρωματικής πλάκας και του καρωτιδικού αυλού κατά την υπερηχογραφία παρουσίασαν σημαντική αύξηση μετά τη χορήγηση του σκιαγραφικού μέσου (p = 0,001, και στις δύο περιπτώσεις). Περαιτέρω, η φωτεινότητα της πλάκας παρουσίασε σημαντική αύξηση τόσο για τις σταθερές, όσο και για τις ασταθείς βλάβες (p = 0,018, και στις δύο περιπτώσεις). Η ανοσοϊστοχημεία ανέδειξε ότι τα νεοαγγεία, όπως εκτιμήθηκαν με αντισώματα έναντι του CD34, ήταν σημαντικά περισσότερα στις ασταθείς (τάξης VI), συγκριτικά με τις σταθερές (τάξης V) βλάβες (36,6 ± 17,4 έναντι 13,0 ± 7,2 αντιστοίχως, p = 0,002). Επιπλέον, η έκφραση των αντισωμάτων VEGF και CD68 ήταν υψηλότερη στις ασταθείς πλάκες (p = 0,021), ενώ η έκφραση των αντισωμάτων CD3 ήταν συγκρίσιμη στις δύο κατηγορίες αθηρωματικών πλακών (p = 0,103). Η συσχέτιση μεταξύ της αύξησης της φωτεινότητας της πλάκας προς τον αγγειακό αυλό κατά την υπερηχογραφία, της πυκνότητας των νεοαγγείων και της παρουσίας φλεγμονωδών κυττάρων ήταν σημαντική μόνο για τις σταθερές αθηρωματικές βλάβες, όπως αυτή εκτιμήθηκε με χρώσεις με αντισώματα έναντι του CD34 (r = 0,800, p = 0,031) και του CD68 (r = 0,791, p = 0,034).Συμπεράσματα: Ενώ τα νεοαγγεία της αθηρωματικής πλάκας, όπως αυτά εκτιμήθηκαν κατά την ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση ήταν περισσότερα για τις επιπλεγμένες τάξης VI βλάβες, η φωτεινότητα της πλάκας κατά την υπερηχογραφία με σκιαγραφικό ήταν εντονότερη στις σταθερές τάξης V βλάβες. Επιπλέον, η σκιαγράφηση της πλάκας με μικροφυσαλλίδες σχετιζόταν στενά με τον αριθμό των νεοαγγείων των σταθερών, αλλά όχι των επιπλεγμένων βλαβών. Η απουσία αυτή συσχέτισης για τις τάξης VI αθηρωματικές πλάκες υποδεικνύει ότι η είσοδος των μικροφυσαλλίδων στις βλάβες αυτές είναι δυνατό να πραγματοποιείται μέσω οδών διαφορετικών από τα νεοαγγεία της πλάκας, όπως είναι οι διασχίσεις αυτής.