Διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών p21WAF1/CIP1 και ARF

Abstract

P21WAF1/CIP1 is a universal cyclin-dependent kinase inhibitor and plays a crucial role in the DNA damage response (DDR) pathway. P21WAF1/CIP1 is a multifunctional molecule whose role in carcinogenesis as a tumor-suppressor is being disputed. In this study, there was used the doxycycline inducible cell system Saos2-p21WAF1/CIP1 Τet ON and there was conducted a gel-free iTRAQ proteomic analysis at three different time points, i.e. 12, 48 and 96 hrs after the induction of p21WAF1/CIP1in order to investigate the effects of the long-term expression of p21WAF1/CIP1 in a p53 null background. Proteomics combined with bioinformatics indicated that the proteins which are mostly affected by p21WAF1/CIP1 are those associated with DNA replication (up-regulation) and mitotis-associated ones (down-regulation). Given that deregulation of the mitotic machinery along with disturbed control of genome replication have been linked to the triggering of genomic instability, the results pay credit to the notion that p21WAF1/CIP1 exhibits a “vicious” pro-tumorigenic facet.On the other hand, ΑRF (alternative reading frame) is also a tumor-suppressive protein, being assigned with multiple intracellular duties. Recently, there was demonstrated an interrelation among the DDR kinase ATM and ARF. Here, there were applied a series of molecular and in situ techniques as well as bioinformatics in order to identify a possible interplay among ARF and the ATM-related kinase ATR or even among ARF and the DDR component MKK7. Further, there were analyzed xenografts in mice in order to characterize the anti-angiogenic activity of ARF when ATM is suppressed. The resulting data indicate that ARF participates in a perplexed network of signaling relationships within the DDR landscape and that ATM suppression may be harnessed as a novel anti-angiogenic strategy in p53-deficient tumors.

Η p21WAF1/CIP1 είναι ένας «καθολικός» αναστολέας των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών και παίζει κρίσιμο ρόλο στο μονοπάτι της απόκρισης στην βλάβη του DNA (DDR). Η p21WAF1/CIP1 είναι ένα πολυλειτουργικό μόριο ενώ στην καρκινογένεση ο αρχικός της χαρακτηρισμός της ως ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης να αμφισβητείται. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκε ένα επαγώγιμο κυτταρικό σύστημα, το Saos2-p21WAF1/CIP1 Τet ON, και διενεργήθηκε ελεύθερη-γέλης πρωτεωμική ανάλυση iTRAQ σε 3 διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επαγωγή της p21WAF1/CIP1, δηλ. στις 12, 48 και 96 ώρες, με σκοπό να αποσαφηνιστούν οι ογκογενετικές ιδιότητες της p21WAF1/CIP1 που πιθανό να σκιαγραφούνται καλύτερα όταν η έκφραση της p21WAF1/CIP1 είναι παρατεταμένη και απουσιάζει η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53. Η πρωτεωμική ανάλυση ακολουθούμενη από αναλύσεις δεδομένων με την βοήθεια βιοπληροφορικής έδειξε πως ανάμεσα στις περισσότερο επηρεαζόμενες πρωτεΐνες που υφίστανται αυξορρύθμιση και μειορρύθμιση από την p21WAF1/CIP1 είναι εκείνες που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA και την μίτωση, αντίστοιχα. Δεδομένου ότι η απορρύθμιση της αντιγραφικής αλλά και της μιτωτικής μηχανής έχουν συνδεθεί με την πυροδότηση της γενωμικής αστάθειας, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας προσφέρουν νέα στοιχεία για την ογκογενετική συμπεριφορά της p21WAF1/CIP1.H ΑRF (alternative reading frame) από την άλλη, είναι και αυτή όπως η p21 Waf1 μία ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη με πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες. Πρόσφατα βρέθηκε πως υπάρχει μία αλληλεπίδραση του μονοπατιού της ARF με την DDR, συγκεκριμένα την DDR κινάση ΑΤΜ. Στην παρούσα μελέτη, εφαρμόζοντας μία σειρά μοριακών και in situ τεχνικών, αλλά και βιοπληροφορικής διερευνήθηκε η σχέση της ARF με την ATM-σχετιζόμενη κινάση ATR και την MKK7 που είχε δειχθεί πως σταθεροποιεί την p53 σε απόκριση σε ογκογονικά ερεθίσματα. Επιπλέον αναλύθηκαν ξενομοσχεύματα σε ποντίκια για να χαρακτηρισθεί η αντι-αγγειογενετική δράση της ΑRF όταν καταστέλλεται η ΑΤΜ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ARF συμμετέχει σε ένα πολυπλοκότερο δίκτυο σχέσεων στην DDR απ’ ότι ήταν τώρα γνωστό και ότι η καταστολή της ΑΤΜ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ακόμα και σε όγκους που δεν εκφράζουν την p53 ως θεραπευτική αντι-αγγειογενετική προσέγγιση μέσω της αυξορρύθμισης της ARF.