Απομόνωση και εξωσωματικός (ex vivo) πολλαπλασιασμός στρωματικών στελεχιαίων κυττάρων από τον ανθρώπινο μυελό των οστών

Abstract

Stromal stem cells (SSC) are produced in vitro when bone marrow (BM) is cultured under standard conditions. They are characterized by fibroblast-like morphology, adherent growth, specific phenotype as defined by flow cytometric analyses and capacity to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes. They also possess remarkable expansion potential and suppress the proliferation of lymphocytes in mixed lymphocyte cultures. They probably originate from perivascular cells or pericytes.In recent years, several experimental studies have shown that SSC are endowed with immunomodulatory properties and with the capacity to promote graft survival in animal models. Furthermore, they have the ability to home to damaged tissue and to produce paracrine factors with anti-inflammatory effects, resulting in functional recovery of the wounded area. In view of these properties, SSC have been tested in pilot studies aimed at accelerating recovery and at treating steroid-resistant aGVHD after allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation. Moreover, there are many ongoing clinical studies phase I and II, investigating the effect of cell therapy with SSC on autoimmune and inflammatory bowel diseases, as well as, on regeneration of tissue with limited renewal capacity (heart, nervous, tissues of the musculoskeletal system, etc.).With the aim to produce ex vivo expanded SSC, in a number sufficient to treat GVHD, but also, the detection of the most appropriate population of bone marrow stem cells for the treatment of patients with heart failure, we studied two distinct populations of SSC (CD105+ and CD271+) and two HSC (CD34+ and CD133+), as they considered until recently.We obtained 10ml BM samples from 23 healthy donors. The above populations were isolated using corresponding antibodies and positive immunomagnetic selection method. The isolated cells were placed in ex vivo expansion and differentiation cultures towards osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages. Surface marker expression of cultured SSC were analyzed by flow cytometry, while chondrogenic, adipogenic and osteogenic differentiation were confirmed by COL2A1, LPL and ALP expression, respectively.All selected populations generated fibroblast-like, adherent cells which maintain their expansion potential for about 5 weeks and 9 sequential passages. The expansion rate and the total number of cells at the end of the culture, does not seem to vary considerably, while, the immunophenotype (CD29+, CD90+, CD44+, CD13+, CD105+, Class I – HLA+, CD14-, CD19-, CD31-, HLA-DR-, CD34- and CD45-) and the ability to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes, as demonstrated by gene expression of LPL, ALP and COL2A1 respectively, confirm their identity as SSC.Significant variation of the above results were observed during cultivation of a CD271+ sample, in which spontaneous generation of diverse cell clusters after third passage, inhibited further proliferation of SSC.This finding led us to the choice of CD105+ cells in order to receive sufficient numbers of SSC to treat GVHD. This approach is now well established in our laboratory.As far as CD133+ and CD34+ cells are concerned, our results very clearly showed that in addition to hematopoietic and endothelial progenitor cells, they also contain SSC, confirming the fact at that time had just begun to emerge for the first population, but, upsetting the literature data for the second.The clinical study that followed was based on these findings. CD133+ and CD133-CD34+ cells were immunomagnetically selected from BM of 26 patients with heart failure and subsequently re-infused to the patients with intracoronary administration. In 8 cases, isolated cells were labeled with 99mTc-hexamethylpropylenamineoxime. This fact revealed that significant number of injected cells homed to the infracted area of the heart, resulting in reduction of size of non-viable areas, improvement of myocardial perfusion and cardiac parameters, thus justifying the conductive of a prospective clinical trial phase II.

Τα ΣΣΚ είναι κύτταρα ινοβλαστικής μορφολογίας που παράγονται στο εργαστήριο, όταν καλλιεργηθεί κατάλληλα μυελός των οστών. Πιθανώς, το in vivo κύτταρο καταγωγής τους να είναι το περιαγγειακό κύτταρο (perivascular cell) ή περικύτταρο (pericyte). Οι in vitro ιδιότητες που χαρακτηρίζουν τα ΣΣΚ ως τέτοια είναι: η προσκόλλησή τους στην επιφάνεια του καλλιεργητικού μέσου, ο συγκεκριμένος ανοσοφαινότυπος, όπως προσδιορίζεται από την κυτταρομετρική ανάλυση και η ικανότητά διαφοροποίησή τους σε οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροβλάστες. Επιπλέον, παρουσιάζουν υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και καταστολή του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων σε μεικτές λεμφοκυτταρικές καλλιέργειες.Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έδειξαν ότι τα ΣΣΚ διαθέτουν και in vivo ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες, συμβάλλοντας στην επιβίωση του μοσχεύματος σε πειραματικά ζωικά μοντέλα. Επιπλέον, προσελκύονται στην περιοχή των τραυματισμένων ιστών προωθώντας τη λειτουργική αποκατάστασή τους με αντιφλεγμονώδη δράση. Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν στη χρησιμοποίησή τους και στον άνθρωπο για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών. Έτσι, έχουν διεξαχθεί πολλές κλινικές μελέτες φάσης Ι και ΙΙ, που αφορούν στην έγχυση ΣΣΚ για την υποβοήθηση της μεταμόσχευσης ΑΣΚ, τη θεραπεία της ανθεκτικής GVHD, την αντιμετώπιση αυτοάνοσων νοσημάτων και φλεγμονωδών νόσων του εντέρου, καθώς και την αναγέννηση ιστών με περιορισμένη ανανεωτική δυνατότητα ( καρδιακός, νευρικός, ιστοί του μυοσκελετικού συστήματος, κ. ά.).Με στόχο την παραγωγή εξωσωματικά εκπτυγμένων ΣΣΚ σε αριθμό επαρκή για την αντιμετώπιση της GVHD, αλλά και την ανεύρεση του καταλληλότερου πληθυσμού ΣΚ του ΜΟ για τη θεραπεία ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια, στο εργαστήριό μας μελετήσαμε δύο χαρακτηριστικούς πληθυσμούς ΣΣΚ (CD105+ και CD271+) και δύο, μέχρι προσφάτως θεωρούμενων, ΑΣΚ (CD34+ και CD133+).Από 23 δείγματα ΜΟ, 10ml το καθένα, απομονώθηκαν οι παραπάνω πληθυσμοί χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα αντισώματα και τη μέθοδο της θετικής ανοσομαγνητικής επιλογής. Ακολούθησαν καλλιέργειες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των διαχωρισθέντων κυττάρων σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα. Η φαινοτυπική ανάλυση των καλλιεργημένων κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής, ενώ η διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα ελέγχτηκε με την έκφραση των γονιδίων της LPL, της αλκαλικής φωσφατάσης και της COL2A1 αντίστοιχα.Και οι 4 πληθυσμοί έδωσαν γένεση σε προσκολλημένα κύτταρα ινοβλαστικής μορφολογίας, που διατηρούν το πολλαπλασιαστικό δυναμικό τους για 5 περίπου εβδομάδες και 9 συνεχείς ανακαλλιέργειες. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού και ο συνολικός αριθμός τους κατά το τέλος της καλλιέργειας, δε φαίνεται να διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ τους, ενώ, ο ανοσοφαινότυπος (CD29+, CD90+, CD44+, CD13+, CD105+, Class I – HLA+, CD14-, CD19-, CD31-, HLA-DR-, CD34- και CD45-) και η ικανότητα διαφοροποίησής τους σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα, όπως καταδεικνύεται και από την έκφραση των γονιδίων της LPL, της αλκαλικής φωσφατάσης και της COL2A1 αντίστοιχα, πιστοποιούν την ταυτότητά τους ως ΣΣΚ.Σημαντική διαφοροποίηση από τα παραπάνω αποτελέσματα παρατηρήθηκε σε ένα δείγμα CD271+ κυττάρων, στο οποίο, η αυτόματη δημιουργία ποικιλόμορφων κυτταρικών σχηματισμών μετά την 3η ανακαλλιέργεια, ανέστειλε τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό των ΣΣΚ.Τo εύρημα αυτό μας οδήγησε στην επιλογή του CD105+ πληθυσμού, προκειμένου να λαμβάνουμε αριθμό ΣΣΚ επαρκή για την αντιμετώπιση της GVHD, γεγονός που αποτελεί πλέον πρακτική του εργαστηρίου μας.Όσον αφορά στους πληθυσμούς των CD133+ και CD34+ κυττάρων, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ξεκάθαρα ότι, πέραν των αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, εμπεριέχουν και ΣΣΚ, επιβεβαιώνοντας το γεγονός που εκείνο το διάστημα είχε αρχίσει να διαφαίνεται για τον πρώτο και ανατρέποντας τα έως τότε βιβλιογραφικά δεδομένα για το δεύτερο.Στα ευρήματά μας αυτά στηρίχτηκε η κλινική μελέτη που ακολούθησε, κατά την οποία πραγματοποιήθηκε επιλογή των CD133+ και CD133-CD34+ κυττάρων από το ΜΟ 26 ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια και επαναχορήγησή τους στον ασθενή με ενδοστεφανιαία έγχυση. Η σήμανση με ραδιοφάρμακο των εγχεόμενων κυττάρων σε 8 περιπτώσεις έδειξε ότι σημαντικός αριθμός από αυτά εντοπίζονταν στην περιοχή του ουλοποιημένου μυοκαρδίου, έχοντας ως αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους των μη βιώσιμων περιοχών, την αύξηση της αιμάτωσής τους και τη βελτίωση των καρδιακών παραμέτρων, δικαιολογώντας έτσι τη διενέργεια μιας προοπτικής κλινικής μελέτης φάσης II.