Η συνεργική δράση της πιβμεσιλλινάμης με το κλαβουλανικό οξύ έναντι στελεχών ουροπαθογόνων της κοινότητας με παραγωγή ESBL λακταμασών και η θέση της στη θεραπεία των ουρολοιμώξεων της κοινότητας

Abstract

Background. Extended-spectrum b-lactamases (ESBLs) have emerged as an important mechanism of blactam resistance among community uropathogens. We characterized the ESBLs of a collection of Escherichia coli isolates recovered from outpatients with urinary tract infection during nationwide surveillance conducted from 2005 to 2006 in Greece, and evaluated the in vitro activity of mecillinam and mecillinam/clavulanate against them. Materials and methods. ESBLs were characterized with PCR and sequencing. In vitro interactions were evaluated with agar dilution with and without clavulanate (4 mg/L) using an inoculum of 104 or 106 cfu/spot as well as with time–kill methodology.Results. Among 48 ESBL producers, 47 (97.9%) were susceptible to mecillinam. CTX-M-type enzymes were produced by 87.2%, with CTX-M-3 being the most prevalent. SHV enzymes were found in 10.6%, VEB enzymes in 2.1%, TEM enzymes in 19.2% and OXA-type enzymes in 12.8%. Synergy with clavulanate was detected in 60.4% using the agar dilution method and in 43.8% using the time–kill methodology. An inoculum effect was detected in 64.6% of isolates, but this phenomenon was inverted and synergy was evidenced for 85.4% with clavulanate. When a high inoculum was used, 60.4% (29/48) were resistant to mecillinam, but 97.9% (47/48) were susceptible in the presence of clavulanate.Conclusions. CTX-M-type enzymes were the most prevalent among ESBL-producing E. coli uropathogens in Greece. Mecillinam may be useful in uncomplicated cystitis caused by ESBL producers with low MICs. The addition of the inhibitor could improve and extend the activity of mecillinam, even in the setting of infection with a high bacterial inoculum, and merits clinical evaluation.

Εισαγωγή. Η παραγωγή β-λακταμασών ευρέως φάσματος Extended-spectrum b-lactamases (ESBLs) από ουροπαθογόνα της τάξεως των Εντεροβακτηριακών αποτελεί ένα αναδυόμενο και συχνά δύσκολο στην αντιμετώπισή του θεραπευτικό πρόβλημα, που αφορά πρωτίστως λοιμώξεις που αποκτώνται ενδονοσοκομειακά άλλα εσχάτως και σε λοιμώξεις εκ της κοινότητας. Η κυριότερη θεραπευτική πρόκληση για τον ιατρό της κοινότητας είναι η έλλειψη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών για από του στόματος εξωνοσοκομειακή χορήγηση εφόσον η βαρύτητα της λοίμωξης το επιτρέπει. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνήσει την in vitro δραστικότητα του συνδυασμού δυο αντιμικροβιακών με δυνατότητα εξωνοσοκομειακής χορήγησης, της μεσιλλινάμης με το κλαβουλανικό οξύ έναντι στελεχών ουροπαθογόνων εκ της κοινότητας με παραγωγή ESBL. Υλικό και μέθοδος. Στα πλαίσια μιας μεγάλης πολυκεντρικής επιδημιολογικής μελέτης αντοχής των ουροπαθογόνων από ασθενείς που αντιμετωπίζονται εξωνοσοκομειακά, στελέχη Escherichia coli που απομονώθηκαν κατά τα έτη 2005-2006 και παρήγαγαν ESBL ταυτοποιήθηκαν μοριακά και μελετήθηκε η ευαισθησία τους in vitro στην μεσιλλινάμη και στο συνδυασμό μεσιλλινάμης με κλαβουλανικό οξύ. H μελέτη της in vitro δραστικότητας της μεσιλλινάμης σε συνέργεια με το κλαβουλανικό οξύ έγινε με τα ακόλουθα βήματα: 1) Προσδιορισμό της MIC της μεσιλλινάμης έναντι ουροπαθογόνων E.coli στελεχών, απομονωθέντων από εξωτερικούς ασθενείς 2) Επιλογή στελεχών με φαινότυπο παραγωγής ESBL 3) Επιβεβαίωση και χαρακτηρισμό του είδους της β-λακταμάσης με την τεχνική ισοηλεκτρικής εστίασης (isoelectric focusing) και αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) 4) Μελέτη της συνέργειας της μεσιλλινάμης με το κλαβουλανικό οξύ με τη μέθοδο διάχυσης στο άγαρ 5) Μελέτη της βακτηριοκτόνου δράσης της μεσιλλινάμης έναντι στελεχών που παράγουν ESBL με τη μέθοδο της καμπύλης θανάτωσης στο χρόνο (killing curves) και μελέτη της συνέργειας της μεσιλλινάμης με το κλαβουλανικό οξύ με την ίδια μέθοδο. Για τις in vitro αλληλεπιδράσεις της μεσιλλινάμης με το κλαβουλανικό (σε σταθερή συγκέντρωση 4 mg/L) χρησιμοποιήθηκαν δύο πυκνότητες βακτηριακού εναιωρήματος (104 και 106 cfu/ίχνος) τόσο στη μέθοδο διάχυσης στο άγαρ όσο και στη μέθοδο της καμπύλης θανάτωσης στο χρόνο. Αποτελέσματα. Από τα 48 ανευρεθέντα ουροπαθογόνα με παραγωγή ESBL τα 47 (ποσοστό 97,9%) ήταν ευαίσθητα in vitro στη μεσιλλινάμη. Τα ένζυμα τύπου CTX-M ήταν κυρίαρχα (87,2%), με συχνότερη την κεφοταξιμάση CTX-M-3. SHV, VEB, TEM και τύπου- OXA ένζυμα ταυτοποιήθηκαν σε ποσοστό 10,6%, 2,1%, 19,2% και 12,8% αντίστοιχα. Συνέργεια με το κλαβουλανικό καταδείχθηκε σε ποσοστό 60,4% με τη μέθοδο της διάχυσης σε άγαρ και σε ποσοστό 43,8% με τη μέθοδο καμπύλης θανάτωσης στο χρόνο. Στο 64,6% των στελεχών παρατηρήθηκε φαινόμενο επίδρασης του βακτηριακού εναιωρήματος, το οποίο όμως αντιστράφηκε με τη συνέργεια που καταδείχθηκε με το καλβουλανικό στο 85,4% των μελετηθέντων στελεχών. Όταν χρησιμοποιήθηκε πυκνό βακτηριακό εναιώρημα, 60,4% των μικροβίων (29/48) ήταν ανθεκτικά στη μεσιλλινάμη αλλά με την προσθήκη κλαβουλανικού το 97,9% εξ’αυτών (47/48) ήταν ευαίσθητα στο συνδυασμό. Συμπεράσματα. Ο επιπολασμός ESBL ενζύμων στα ουροπαθογόνα E.coli από τον ελληνικό χώρο κατά τα έτη 2005-2006 ήταν σχετικά χαμηλός (1.9%) και οι κεφοταξιμάσες (CTX-M) ήταν οι συχνότερες ESBL που ανιχνεύθηκαν. Μεταξύ μεσιλλινάμης και κλαβουλανικού διαπιστώθηκε συνέργεια σε 60% και αδιαφορία σε 40% των E.coli που παρήγαγαν ESBL. Όλα τα στελέχη με MIC ≥4 μg/ml παρουσίασαν συνέργεια. Η μεσιλλινάμη δυνατόν να αποτελεί μια δόκιμη θεραπεία για ανεπίπλεκτες λοιμώξεις του ουροποιητικού από ουροπαθογόνα που παράγουν ESBL με χαμηλές ελάχιστες ανασταλτικές πυκνότητες. Η προσθήκη κλαβουλανικού οξέος αυξάνει και επεκτείνει τη δραστικότητά της έναντι των ESBL-παραγωγών ουροπαθογόνων ακόμη και σε υψηλές βακτηριακές συγκεντρώσεις. Κατά συνέπεια, ο συνδυασμός μεσιλλινάμης με κλαβουλανικό οξύ χρήζει περαιτέρω μελέτης σε κλινικό επίπεδο.