Η σημασία της έκφρασης του αντιγόνου επιιφανείας CD86 στην παθογένεια στην σήψη από πνευμονία του αναπνευστήρα

Abstract

Cluster of Differentiation 86 (also known as CD86 and B7-2) is a protein expressed on antigen-presenting cells, that provides costimulatory signals necessary for T cell activation and survival. The present study aims to investigate the expression of CD86, on the cell surface of peripheral blood monocytes, in patients with sepsis. A total of 124 patients with septic syndrome were enrolled in the study. The study was approved by the Ethics Committee of the participating hospitals and written informed consent was provided by the patients or their relatives. Within less than 24 hours upon the advent of signs of sepsis and upon enrolment in the study, blood was collected and transported within 2 h to the central laboratory for processing on the same day. More precisely, the workload on the day of sampling involved (i) tube centrifugation and storage of serum at -70°C, (ii) isolation of monocytes (iii) flow cytometry on freshly isolated monocytes, for determination of % expression of CD86 on their cell surface and (iv) functional analysis of freshly isolated monocytes and neutrophils. This was done by stimulation of the monocytes. The supernatants after stimulation were stored at -70°C. As such, no cell populations were kept frozen, whereas the stimulation of monocytes was real time. Enrolled patients were followed-up on a daily basis for a total of 28 days.Mann-Whitney U test results showed that day 1 % CD86 on monocytes, but not CD86 MFI, differed between septic patients, who survived and those, who died. Mean rank of CD86 MFI was 55,04 in patients, who survived and 46,78 in those, who died within 28 days (p:0,197, not statistically significant). On the other hand, mean rank of % CD86 was 62,9 in survivors and 42,06 in patients who died (p:0,002, statistically significant). With performance of ROC Curve analysis, a cut-off value of 54,5% was chosen for CD86 expression, which appears to be of prognostic importance, concerning the outcome of patients. Performance of Fisher’s Exact test showed a difference of statistical significance in the survival of patients, in relation to their value of % CD86 on monocytes, on day 1, < or ≥ 54,5%. (p:0,033). Time of survival was estimated after Kaplan-Meier analysis, which showed a significant difference in patient survival, after day 15, as patients with % CD86 value ≥54,5 survived longer (p:0,036). Estimation of Mantel-Haenszel Common Odds Ratio showed significant danger of death in patients with % CD86 on monocytes on day 1 <54,5% [p:0,030, odds ratio for survival (OR): 0,394; 95% confidence interval (CI): 0,170-0,912]. Estimation of survival among patients, whose monocytes responded with >5-fold release of both TNFα and IL-6, after LPS stimulation, and non responders, in relation to the cut-off value of % CD86, was performed with Χ2 test. Fischer’s Exact Test showed a difference in the survival of non-responders (p:0,037), but not in survival rates of responders (p:0,533). Common Odds Ratio Mantel-Haenszel estimation showed that only in non-responders, who survived, appeared to be a significant correlation of survival with % CD86 value of ≥ 54,5% [p:0,028, odds ratio for survival (OR): 0,693; 95% confidence interval (CI): 0,484-0,993]. Finally, serum levels of sCD40L, IL-10, IL-6, IL-8, MDA, CRP and PCT on day 1, where correlated to % CD86 value of monocytes, on day 1. Performance of Mann-Whitney U test showed statistically significant correlation between % CD86 and IL-6, as well as between % CD86 and PCT. Further statistical correlation between % CD86 and PCT was performed, after assessment of the non-parametric co-efficient of Spearman (rs), which showed an important level of statistical significance of p<0,01.Our study highlights the relation of elevated expression of CD86 on monocytes, on day 1 and an improved outcome of septic patients. It also suggests a cut-off value of 54,5% of monocytes CD86 on day 1, which might be of prognostic importance, in the assessement of septic patients. Finally, it unfolds a tight correlation between % CD86 and PCT.

Το CD86 αποτελεί αντιγόνο της επιφάνειας των μονοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων, που λειτουργεί ως συνδιεγερτικό μόριο στην αντιγονική σύναψη, κατά τη μεταφορά της ανοσολογικής διέγερσης από τη μη-ειδική στην ειδική ανοσιακή απόκκριση (101, 102). Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί, να μελετήσει την έκφραση του αντιγόνου επιφανείας CD86, επί των μονοκυττάρων του αίματος, σε ασθενείς με σήψη.Συνολικά μελετήθηκαν 124 ασθενείς με σηπτικό σύνδρομο. Η μελέτη διεξήχθη μετά την έγκριση της Επιστημονικής Επιτροπής των Νοσοκομείων, σύμφωνα με την ισχύουσα νομοθεσία. Επίσης, κάθε διαδικασία της μελέτης διεξήχθη, κατόπιν της ενημέρωσης και της λήψης γραπτής συγκατάθεσης από τους συγγενείς των ασθενών. Εντός 24 ωρών από την πλήρωση των κριτηρίων εισόδου και με την εισαγωγή του ασθενούς στη μελέτη γίνονταν αιμοληψία και αποστολή δειγμάτων αίματος στο κεντρικό εργαστήριο, μέσα στις επόμενες δυο ώρες, ώστε να επεξεργαστεί την ίδια μέρα. Για όλους τους ασθενείς γινόταν απομόνωση μονοκυττάρων περιφερικού αίματος, για κυτταρομετρία ροής, καθώς και επώαση με ενδοτοξίνη και μέτρηση παραγόντων στο υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας. Επίσης γινόταν φυγοκέντρηση και φύλαξη του ορού του αίματος στους -70°C, για άλλες μετρήσεις. Οι ασθενείς παρακολουθούνταν καθημερινά από τους θεράποντες για τυχόν μεταβολές στην κλινική τους εικόνα, επί συνόλου 28 ημερών. Με τη στατιστική δοκιμασία Mann-Whitney U, φαίνεται ότι το % CD86, αλλά όχι το MFI CD86, διαφέρει μεταξύ των σηπτικών ασθενών, που επιβίωσαν κι αυτών, που πέθαναν. Το MFI CD86 είχε διάμεση τιμή 55,04 στους επιβιώσαντες και 46,78 στους αποβιώσαντες, διαφορά, που δεν είναι στατιστικά σημαντική (p:0,197). Αντιθέτως, το % CD86 είχε διάμεση τιμή 62,9 στους επιβιώσαντες έναντι 42,06 στους αποβιώσαντες, διαφορά στατιστικά σημαντική (p:0,002). Με χρήση καμπύλης ROC, επιλέχθηκε η οριακή τιμή 54,5% του CD86, που παρουσιάζει προγνωστική αξία, σε σχέση με την επιβίωση των ασθενών. Έπειτα, το Fisher’s Exact Test έδειξε, ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στην επιβίωση των ασθενών, ανάλογα με το αν είχαν τιμή % CD86 μονοκυττάρων ημέρας 1 < ή ≥ του 54,5%. (p:0,033). Επιπλέον, με το σχεδιασμό της καμπύλης επιβίωσης Kaplan-Meier, η σύγκριση της μέσης επιβίωσης στις ομάδες ασθενών με % CD86 < ή ≥ του 54,5%, έδειξε σημαντική διαφορά στην επιβίωση των ασθενών με % CD86≥54,5 μετά την 15 ημέρα (p:0,036). Η εκτίμηση του Mantel-Haenszel Common Odds Ratio έδειξε, ότι υπάρχει σημαντικός κίνδυνος θανάτου των ασθενών, με % CD86 μονοκυττάρων ημέρας 1 μικρότερο του 54,5% [p:0,030, odds ratio for survival (OR): 0,394; 95% confidence interval (CI): 0,170-0,912]. Η διαφορά στην επιβίωση των ασθενών, που απάντησαν με >5 φορές αυξημένες τιμές TNFα και IL-6 στη διέγερση, κι αυτών, που δεν απάντησαν επαρκώς, σε σχέση με την οριακή τιμή του % CD86, εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία Χ2 και το Fischer’s Exact Test έδειξε, ότι η διαφορά στην επιβίωση ισχύει στους ασθενείς, που δεν απάντησαν επαρκώς (p:0,037), αλλά όχι σε αυτούς, που απάντησαν ικανοποιητικά (p:0,533). Η εκτίμηση του πηλίκου πιθανοτήτων (odds ratio) μας έδειξε, ότι μόνο στους ασθενείς με μη ικανοποιητική απάντηση, οι οποίοι τελικά επιβίωσαν, υπάρχει σημαντική συσχέτιση της επιβίωσης με την τιμή του % CD86 ≥ 54,5%, με το Common Odds Ratio Mantel-Haenszel να έχει p:0,028 [odds ratio for survival (OR): 0,693; 95% confidence interval (CI): 0,484-0,993]. Μετά, συσχετίστηκαν οι μετρήσεις των sCD40L, IL-10, IL-6, IL-8, MDA, CRP και PCT ημέρας 1 στον ορό των ασθενών, με την τιμή του % CD86 των μονοκυττάρων της ημέρας 1, με δοκιμασία Mann-Whitney, η οποία έδειξε στατιστικώς μη σημαντική συσχέτιση για όλους τους παράγοντες, πλην της προκαλσιτονίνης (PCT) και της IL-6. Η μη παραμετρική δοκιμασία συσχέτισης Spearman’s rho έδειξε πολύ σημαντική συσχέτιση, με τιμή στατιστικής σημαντικότητας σε επίπεδο p<0,01, ανάμεσα στις τιμές της PCT και του % CD86.Η μελέτη μας αναδεικνύει τη σύνδεση της αυξημένης έκφρασης του CD86 των μονοκυττάρων με την καλή πρόγνωση των σηπτικών ασθενών. Επιπλέον, προτείνει την οριακή τιμή της έκφρασης του CD86 των μονοκυττάρων πρώτης ημέρας 54,5%, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστική τιμή για καλύτερη έκβαση των ασθενών. Επίσης, η μελέτη μας καταδεικνύει τη στενή συσχέτιση της τιμής έκφρασης του CD86 με την αντίστοιχη της προκαλσιτονίνης.