Κλωνοτυπική ανάλυση αλληλουχιών βαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgH) σε ασθενείς με μακροσφαιριναιμία Waldenström και συσχέτιση με την κλινική τους πορεία και έκβαση

Abstract

Waldenström’s Macroglobulinemia (WM) cells express a uniqueclonotypic rearrangement of heavy chain immunoglobulin (IgH) genes in eachindividual patient. In this study we characterized IgH genes rearrangementsand somatic hypemutations (SHM) in a cohort of WM patients and weinvestigated any eventual correlation with patients’ clinical features. Thefrequency of the ΜΥD88 L265P mutation was also investigated and correlatedwith the IgH genes rearrangements.36 patients were studied (median age 64y, 19 males and 17 females,symptomatic 72%, asymptomatic 28%) of whom 45%, 39% and 16% werestaged IPSSWM 1, 2 and 3 respectively. Median time to treatment was 13months and median overall survival 61 months. DNA was extracted frompatients’ samples (blood and bone marrow - bone marrow mononuclear cells, bone marrow smears and bone marrow biopsies), IgH VDJ locus wasamplified by PCR using the Biomed-2 strategy, monolclonal VDJ rearrangedfragments were sequenced, and analyzed through the internationalimmunogenetics information system (www.imgt.org). 31 patients’ sampleswere also investigated for ΜΥD88 L265P mutation detection by AS-PCR.The most frequent family usage was IGVH3 (73%) while IGVH3-23and IGVH3-74 segments were used in 24,4% and 18,9% respectively.Somatic hypermutation (>2% deviation from the germline) was seen in all butthree cases (92%). Mean percentage of mutations in all cases, IGVH3 family,IGVH3-23 and IGVH3-74 segments was 7,5%, 8%, 9,4% and 7,5%respectively. CDR3 length was short (≤17 amino acids) in 81% of all cases, although in the three unmutated cases the mean of CDR3 length was 22,3 amino acids. 61,9% of the patients were positive for the ΜΥD88 L265Pmutation. The above-mentioned findings were compared with patients’physical and routine laboratory workup results and no correlations were foundnor was it the case with time to treatment or survival.Conclusions: WM IgH genes’ repertoire differed from those observedin normal B-cells, and other B-cell disorders such as MZL and B-CLL/SLL.IGVH3-23 and IGVH3-74 is overexpressed in WM patients. In addition highIGVH mutation supports a derivation of WM cells from postgerminal centermemory B cells. However the detection of three unmutated (and seldomexpressed in WM) IGHV gene clones in three ΜΥD88 L265P negative WMpatients, which bear long CDR3 segments, could support that thetransformation leading to WM does not target only postgerminal center B cells which bears SHM, and reinforces the existence of biological differencesbetween WM MYD88 mutated and unmutated cases.

Σε κάθε ασθενή με Μακροσφαιριναιμία Waldenström (MW) τα κύτταρατης νόσου εκφράζουν μοναδική κλωνοτυπική αναδιάταξη των γονιδίων τηςβαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgH). Στην παρούσα μελέτη γίνεταιπροσπάθεια ταυτοποίησης των χρησιμοποιούμενων αναδιατάξεων και τωνσωματικών υπερμεταλλάξεων (ΣΥΜ) των γονιδίων της IgH σε μια σειράασθενών με ΜW και επιχειρείται η ανεύρεση σχέσης με τα κλινικά καιεργαστηριακά χαρακτηριστικά των ασθενών. Μελετάται η συχνότητα τηςμετάλλαξης ΜΥD88 L265P και γίνεται προσπάθεια συσχετισμού με τιςαναδιατάξεις.Μελετήθηκαν 36 ασθενείς (διάμεση ηλικία 64έτη, 19 άνδρες και 17γυναίκες, 72% συμπτωματικοί και 28% ασυμπτωματικοί) εκ των οποίων 45%,39% και 16% ήταν σταδίου 1, 2 και 3 (IPSSWM) αντίστοιχα. Ο διάμεσοςχρόνος έναρξης θεραπείας ήταν 13 μήνες και η διάμεση επιβίωση 61 μήνες.Έγινε απομόνωση DNA από δείγματα αίματος και μυελού των οστών(μονοπύρηνα κύτταρα μυελού των οστών, επιχρίσματα μυελού, οστεομυελικέςβιοψίες), στη συνέχεια ενισχύθηκε το πεδίο IgH-VDJ με PCR σύμφωνα με τιςοδηγίες της Biomed-2 strategy, έγινε καθορισμός αλληλουχίας βάσεων τωνμονοκλωνικών αναδιατάξεων VDJ, και τελικά ανάλυση μέσω του διαθέσιμουστο διαδίκτυο σύστημα “the international immunogenetics information system”(www.imgt.org). Έλεγχος για την ανίχνευση της μετάλλαξης ΜΥD88 L265Pπραγματοποιήθηκε σε 31 από τους 36 ασθενείς με AS-PCR.Στη παρούσα μελέτη μεγαλύτερη συχνότητα χρήσης έχει η οικογένειαIGVH3 (73%), τα δε γονίδια IGHV3-23 και IGHV3-74 χρησιμοποιούνται σευψηλά ποσοστά, 24,4% και 18,9% αντίστοιχα. ΣΥΜ (>2% απόκλιση από τη βλαστική σειρά) παρατηρήθηκε σε όλες εκτός από 3 περιπτώσεις (92%). Ημέση τιμή του ποσοστού ΣΥΜ συνολικά, στην οικογένεια IGΗV3, στα γονίδιαIGHV3-23 και IGV3-74 ήταν 7,5%, 8%, 9,4% και 7,5% αντίστοιχα. To μήκοςτων CDR3 ήταν μικρό (≤17αμινοξέα) σε 81% των περιπτώσεων, ωστόσο στις3 αμετάλλακτες περιπτώσεις η μέση τιμή τoυ μήκους των CDR3 ήταν 22,3αμινοξέα. 61,9% των ασθενών ήταν θετικοί για την μετάλλαξη ΜΥD88 L265P.Έγινε σύγκριση των παραπάνω ευρημάτων με τα κλικοεργαστηριακάευρήματα των ασθενών, του χρόνου έναρξης θεραπείας και την επιβίωση,αλλά δεν διαπιστώθηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση.Συμπεράσματα: Το ρεπερτόριο των γονιδίων της IgH στη ΜWδιαφέρει από αυτό που παρατηρείται στα φυσιολογικά Β-λεμφοκύτταρα, και σε άλλες Β-νεοπλασίες όπως το MZL και η B-ΧΛΛ/SLL. Παρατηρούνταιυπερέκφραση των γονιδίων IGVH3-23 και IGVH3-74 και αυξημένα ποσοστάΣΥΜ, γεγονός που υποστηρίζει την άποψη ότι ο νεοπλασματικόςμετασχηματισμός στην ΜW λαμβάνει χώρα σε ένα Β-λεμφοκύτταρο μνήμηςπου έχει διέλθει το βλαστικό κέντρο. Ωστόσο η ταυτοποίηση σε 3 ασθενείς μεMW που δεν φέρουν την μετάλλαξη ΜΥD88 L265P τριών κλώνων μεαμετάλλακτα γονίδια IGHV που δεν υπερεκφράζονται στη MW, και πουπαρουσιάζουν μεγάλου μήκους CDR3 περιοχές, θα μπορούσε ναυποδηλώσει ότι το συμβάν νεοπλασματικού μετασχηματισμού που οδηγεί στηνόσο MW δεν στοχεύει αποκλειστικά και μόνο σε σωματικά μεταλλαγμένα Β-λεμφοκύτταρα που έχουν διέλθει το βλαστικό κέντρο και ενισχύει μάλλον τηνάποψη της ύπαρξης βιολογικών διαφορών μεταξύ μεταλλαγμένων και σε άλλες Β-νεοπλασίες όπως το MZL και η B-ΧΛΛ/SLL. Παρατηρούνταιυπερέκφραση των γονιδίων IGVH3-23 και IGVH3-74 και αυξημένα ποσοστάΣΥΜ, γεγονός που υποστηρίζει την άποψη ότι ο νεοπλασματικόςμετασχηματισμός στην ΜW λαμβάνει χώρα σε ένα Β-λεμφοκύτταρο μνήμηςπου έχει διέλθει το βλαστικό κέντρο. Ωστόσο η ταυτοποίηση σε 3 ασθενείς μεMW που δεν φέρουν την μετάλλαξη ΜΥD88 L265P τριών κλώνων μεαμετάλλακτα γονίδια IGHV που δεν υπερεκφράζονται στη MW, και πουπαρουσιάζουν μεγάλου μήκους CDR3 περιοχές, θα μπορούσε ναυποδηλώσει ότι το συμβάν νεοπλασματικού μετασχηματισμού που οδηγεί στηνόσο MW δεν στοχεύει αποκλειστικά και μόνο σε σωματικά μεταλλαγμένα Β-λεμφοκύτταρα που έχουν διέλθει το βλαστικό κέντρο και ενισχύει μάλλον τηνάποψη της ύπαρξης βιολογικών διαφορών μεταξύ μεταλλαγμένων και αμετάλλακτων για το γονίδιο MYD88 ασθενών με MW.