Βιοχημική και φαρμακολογική μελέτη της θειικής χονδροϊτίνης σε βιολογικά δείγματα

Abstract

Glycosaminoglycans (GAGs) are linear acidic heteropolysaccharides composed of repeating disaccharide units of hexosamines and uronic acids. The heterogeneity of GAGs is attributed to their molecular size, charge density and physicochemical properties. The role of chondroitin sulfate (CS) is particularly important in various pathological conditions such as osteoarthritis, cancer, atherosclerosis and inflammation Additionally, CS has been widely used, in various pharmaceutical preparations and dietary supplements, for the treatment of symptoms associated with diseases such as, osteoarthritis. In several studies, CS determination is reported, in order to evaluate quantitative and structural modifications associated with a pathological condition and/or its progress. A simple and robust methodology for determining CS in biological samples is a prerequisite to the conduct of pharmacokinetic studies, which could shed light on issues of structure-catabolism function relationship. Simplicity and quantitative isolation of CS from the complex biological samples, such as blood serum is a key requirement for the development of a rapid, accurate and robust bioanalytical procedure. Therefore, the aim of this study was to apply a reliable sample treatment protocol and a Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) methodology for the determination of CS concentration and sulfation pattern in various biological samples. FACE analysis was performed under specific electrophoretic conditions and the data were validated by a well established Capillary Electrophoresis (CE) methodology. Precisely, a procedure involving two enzymic treatments and two precipitation steps was applied for determination of CS content and disaccharide sulfation pattern in various biological samples. Firstly, the protocol was used for CS analysis in blood serum and then in lens capsule (tissue), aqueous humor and culture medium and CS structure and modifications were determined by FACE analysis. Samples were analyzed by FACE, after treatment according to the protocol and derivatization of Δ-disaccharides with 2-AMAC. FACE results were compared and validated by the results obtained by CE. It was established that FACE analysis, after treatment of the biological sample according to the protocol, can be applied for CS determination in complex biological samples, even tissues. Specifically, information can be obtained about the sulfation pattern of CS and in most cases quantification of CS Δ-disaccharides in biological samples is also possible. Consequently, FACE analysis can be used as a cheap, fast and simple analytical technique for the determination of CS in various biological samples, including tissues. However, the well established CE methodology should be applied, when high sensitivity and precision is required for the qualitative and quantitative determination of CS in biological samples, for example to conduct pharmacokinetic studies or even search for useful biomarkers in normal and pathological situations.

Πειραματικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) επηρεάζουν τον βιολογικό ρόλο των πρωτεογλυκανών (PGs) πάνω στις οποίες είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένες. Η χημική ετερογένεια των GAGs αναφορικά με τον τύπο θείωσης καθορίζει σημαντικά βιολογικά φαινόμενα, όπως την οργάνωση της δομής των ιστών, τις αλληλεπιδράσεις με μόρια του εξωκυττάριου χώρου (ECM), καθώς και τη διηθητική και μεταστατική συμπεριφορά σε διάφορους τύπους καρκίνου. Έχει δειχθεί ότι, ο ρόλος της θειικής χονδροϊτίνης (CS ) είναι ιδιαίτερα σημαντικός σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως η οστεοαρθρίτιδα, ο καρκίνος, η αθηροσκλήρυνση και η φλεγμονή. Επιπλέον, η CS έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως, σε διάφορα φαρμακευτικά σκευάσματα και συμπληρώματα διατροφής, για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων που σχετίζονται με ασθένειες, όπως η οστεοαρθρίτιδα. Σε αρκετές μελέτες, ο προσδιορισμός της CS έχει πραγματοποιηθεί προκειμένου να μελετηθούν ποσοτικές και δομικές τροποποιήσεις που σχετίζονται με την παθολογική κατάσταση ή/και την πρόοδο της. Ωστόσο, η ποσοτική απομόνωση της CS από σύνθετα βιολογικά δείγματα, όπως ο ορός αίματος προϋποθέτει την ανάπτυξη μιας γρήγορης και αξιόπιστης βιοαναλυτικής μεθοδολογίας. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να εφαρμοστεί αρχικά ένα αξιόπιστο πρωτόκολλο κατεργασίας δείγματος και μία μεθοδολογία FACE για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της CS σε διάφορα βιολογικά δείγματα. Η FACE ανάλυση πραγματοποιήθηκε υπό συγκεκριμένες συνθήκες και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν συγκρίθηκαν και επικυρώθηκαν με μία καθιερωμένη σε Διεθνές επίπεδο μεθοδολογία τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (CE). Συγκεκριμένα, τα δείγματα κατεργάστηκαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιλαμβάνει δύο στάδια ενζυμικής κατεργασίας και δύο στάδια κατακρήμνισης. Το πρωτόκολλο κατεργασίας εφαρμόστηκε αρχικά στον ορό αίματος και στη συνέχεια σε δείγματα από περιφάκιο, υδατοειδές υγρό και υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας και στη συνέχεια τα δείγματα αναλύθηκαν με FACE μετά από παραγωγοποίηση με 2-AMAC. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης FACE συγκρίθηκαν και επικυρώθηκαν από τα αντίστοιχα αποτελέσματα που ελήφθησαν με CE ανάλυση των δειγμάτων. Διαπιστώθηκε ότι η ανάλυση FACE, μετά από κατεργασία του βιολογικού δείγματος σύμφωνα με το πρωτόκολλο, μπορεί να εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό της CS σε σύνθετα βιολογικά δείγματα, ακόμη και σε ιστούς. Συγκεκριμένα, πληροφορίες μπορούν να ληφθούν για την εικόνα θείωσης της CS και στις περισσότερες περιπτώσεις είναι εφικτός ο ποσοτικός προσδιορισμός των Δ-δισακχαριτών CS στα βιολογικά δείγματα. Κατά συνέπεια, η ανάλυση FACE μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια οικονομική, γρήγορη και απλή αναλυτική τεχνική για τον προσδιορισμό της CS σε διάφορα βιολογικά δείγματα. Η καθιερωμένη μεθοδολογία CE μπορεί εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό της CS σε βιολογικά δείγματα, όταν απαιτείται υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, όπως για παράδειγμα για τη διεξαγωγή φαρμακοκινητικών μελετών ή ακόμη και για την αναζήτηση χρήσιμων βιοχημικών δεικτών τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις.