Επιδημιολογική μελέτη του ιού Noda σε αλιεύματα, δίθυρα και ιχθείς και μελέτη της παθογένειας του ιού στο λαβράκι σε σχέση με τον εντοπισμό της πύλης εισόδου του ιού στον οργανισμό και τον τρόπο εξάπλωσής του στους ιστούς του ψαριού

Abstract

Viral encephalopathy and retinopathy (VER) is a neuropathological infectious disease that is considered as the most serious viral threat affecting marine farmed species in the Mediterranean region. The causative agent of VER is a small, non-enveloped, round-shaped RNA virus of the family Nodaviridae within the genus Betanodavirus. The aim of this thesis was to investigate the occurrence of Betanodaviruses in selected fish and bivalves of the Greek territorial waters and to study some unclear aspects of virus pathogenesis in a highly sensitive fish species, the European sea bass, Dicentrarchus labrax. For this purpose, experiments were conducted that are presented in two Chapters. In the first Chapter, the sample collection, the catching regions and the real-time PCR assay used to detect Betanodavirus genome are described. The results revealed a wide range of susceptible hosts and extensive dispersion of mainly RGNNV strains in the Greek seawaters. Betanodaviruses were detected in 10 species, reported for the first time here. A RGNNV/SJNNV reassortant was also identified in one fish species. Phylogenetic analysis revealed low genetic variability even between wild and farmed populations of different catching regions. This is a strong indication that wild fish species can act as carriers or reservoir of betanodaviruses. In the second Chapter, the infection capacity of a Betanodavirus, the Redspotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV) was assessed, after experimental challenge via conjunctiva, gastrointestinal tract, gills and lateral line in Dicentrarchus labrax juveniles. The development of typical clinical signs of VER, in combination with the presence of vacuolar degeneration and neuronal necrosis on Central Nervous System and retina as well as the detection of virus genome in fish tissues in all experimental groups, indicated that RGNNV can invade its host through a variety of routes. Although, the initial localization of the virus and its dispersal pattern, until the infection of the brain and retina, differed between challenged groups, the viral progression in the Central Nervous System seems to be achieved through nerve paths. Another crucial point was that viraemia appeared only after the installation of infection in the brain.

Η ιογενής εγκεφαλοπάθεια και αμφιβληστροειδοπάθεια (Viral Encephalopathy and Retinopathy, VER) είναι μία νευροπαθολογική νόσος των ψαριών που έχει θεωρηθεί ως η πιο σοβαρή ιογενής απειλή στην εκτροφή ειδών θαλασσινού νερού στην περιοχή της Μεσογείου. Αιτιολογικός παράγοντας της νόσου είναι ένας RNA-ιός, που ανήκει στο γένος Betanodavirus της οικογένειας Nodaviridae (Carstens et al., 2000). Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη στοιχείων επιδημιολογίας των Betanoda-ιών σε άγρια και εκτρεφόμενα είδη ψαριών και δίθυρων που απαντώνται στα ελληνικά θαλάσσια ύδατα και η διερεύνηση πτυχών της παθογένειας του ιού σε ένα εξαιρετικά ευαίσθητο είδος, το ευρωπαϊκό λαβράκι, Dicentrarchus labrax. Για το σκοπό αυτό διενεργήθηκαν πειραματισμοί που περιγράφονται σε δύο κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο παρατίθενται αναλυτικά οι δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν για τον εντοπισμό του ιού σε άγριους και εκτρεφόμενους πληθυσμούς και το πρωτόκολλο της δοκιμής real-time PCR που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση γενώματος Betanoda-ιών. Τα αποτελέσματα φανέρωσαν ότι μεγάλο εύρος ειδών τελεόστεων ιχθύων και δίθυρων αποτελούν ξενιστές Betanoda-ιών και συγκεκριμένα στελεχών που στην πλειοψηφία τους κατατάσσονται στον γενότυπο RGNNV. Ο ιός εντοπίστηκε σε 10 είδη για πρώτη φορά διεθνώς, ενώ ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανίχνευση ενός RGNNV/SJNNV ανασυνδυασμού σε σαφρίδι. H φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών τμήματος του γονιδίου της πολυμεράσης (pol) και της καψιδιακής πρωτεΐνης (cp) του ιού στα θετικά δείγματα, κατέδειξε ότι η γενετική παραλλακτικότητα μεταξύ των απομονώσεων ήταν μικρή, ακόμα και μεταξύ άγριων και εκτρεφόμενων πληθυσμών διαφορετικών περιοχών αλίευσης. Το γεγονός αυτό αποτελεί ισχυρή ένδειξη ότι πολλά είδη άγριων ψαριών αποτελούν δεξαμενή του ιού RGNNV, από όπου ο ιός μπορεί να μεταδοθεί στα ευαίσθητα, ελεύθερα ή εκτρεφόμενα, είδη. Στο δεύτερο κεφάλαιο αξιολογήθηκε η λοιμογόνος ικανότητα και διασπορά του ιού Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV) στον οργανισμό, μετά από ενοφθαλμισμό του ιού στον οφθαλμό, τα βράγχια, την πλευρική γραμμή και τον οισοφάγο ιχθυδίων ευρωπαϊκού λαβρακιού, Dicentrarchus labrax. Η εκδήλωση θνησιμότητας και κλινικής συμπτωματολογίας τυπικής ιογενούς εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας σε συνδυασμό με την παρατήρηση κενοτoπιώδους εκφύλισης στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή και την ανίχνευση του ιικού γενώματος σε ιστούς λαβρακιών από όλες τις πειραματικές ομάδες, υποδηλώνουν ότι ο ιός RGNNV εισέρχεται στον οργανισμό μέσω πολλών διαφορετικών οδών. Παρόλο που ο αρχικός εντοπισμός και το μοτίβο διασποράς του στους ιστούς διέφερε μεταξύ των πειραματικών ομάδων, η εξάπλωση του ιού RGNNV στον εγκέφαλο και τον οφθαλμό φαίνεται ότι επιτυγχάνεται νευρογενώς. Ιαιμία εκδηλώθηκε μόνο μετά την εγκατάσταση της μόλυνσης στον εγκέφαλο και ενώ ο ιός είχε ήδη ανιχνευθεί σε νευρικούς ιστούς.