Απομόνωση σε καλλιέργειες και ανοσοϊστοχημική μελέτη των νεοπλασματικών κυττάρων σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνο

Abstract

More than one million deaths are caused each year worldwide by Hepatocel-lular carcinoma (HCC). Risk factors such as cirrhosis and chronic hepatitis Bor C viral infections, have a high-enough prevalence. This type of primary tumor is resistant, so far, to optimal therapy due to de-layed diagnosis in early stages, or to minimal response, if any, to adjuvant th-erapy or radiotherapy. Hepatectomy remains the treatment of choice, providedthe tumor is resectable.The purpose of the present study was to examine the possibility of revealingin vitro, certain characteristics of neoplastic hepatocytes, in a culture model,taken from specimens of hepatectomy, on patients suffering primary hepato-cellular carcinoma.We have used the tissue-culture model which was developed in a reprodu-cible fashion, in the Surgical Experimental Laboratory of A΄ Propedeutic SurgicalClinic, Medical School, University of Athens, at IPPOKRATION HOSPITAL (Di-rector Prof. G.K.Zografos- Chiefs of the Lab. A. Kataki and A.Devetzi)

Η καλλιέργεια ηπατοκυττάρων υπήρξε πάντα δυσχερές εργαστηριακό εγχείρημα, παρά τις επίμονες προσπάθειες πολλών ερευνητών διεθνώς. Στο Πειραματικό Εργαστήριο της Α΄Προπαιδευτικής Χειρουργικής Κλινικής, τουΠανεπιστημίου Αθηνών (Δ/ντής ο καθηγητής κ. Γεώργιος Κ. Ζωγράφος), στο ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ Γ.Ν.Α Νοσοκομείο Αθηνών, οι υπεύθυνοι Βιολόγοι κ.κ. Αγάπη Κατάκη και Αναστασία Δεβετζή, ανέπτυξαν μία απολύτως αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδο, την οποία και ακολουθήσαμε στην παρούσα εργασία. ΑΣΘΕΝΕΙΣ - ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙΟ σκοπός ήταν να μελετήσουμε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών ηπατοκυττάρων σε ασθενείς με πρωτοπαθή ηπατοκυτταρικό καρκίνο(ΗΚΚ), με προοπτική τα αποτελέσματα να αποτελέσουν ένα πιθανό οδηγό στην φαρμακευτική αντιμετώπιση της νόσου. Ως γνωστόν, η συγκεκριμένη κακοήθης πάθηση του ήπατος, είναι ανθεκτική στην χημειο-ακτινοθεραπεία και η ηπατεκτομή αποτελεί σήμερα την πρώτη γραμμή θεραπείας. Για τον σκοπό αυτόν, εκτός της επιτυχούς απομόνωσης, σε μονοκαλλιέργειες φυσιολογικών και νεοπλασματικών ηπατοκυττάρων, από υγιές ηπατικό παρέγχυμα (16 μάρτυρες που υπεβλήθησαν σε λαπαροσκοπική χολοκυστεκτομή, κατόπιν έγγραφης συναινεσης) και νεοπλασματικό ιστό από 20 ασθενείς μετα ηπατεκτομή για ΗΚΚ, διενεργήθη και ανοσο-ιστοχημική μελέτη με ειδικά αντισώματα για την ολοκλήρωση της αποκάλυψης κάποιων ιδιαιτέρων χαρακτηριστικών των καρκινικών κυττάτων. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήσαμε ήταν τα Hep-Par 1, CD90, Oct ¾, CXCR4/CD184. Ένζυμα απομονώσεως για τις μονοκαλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν κολλαγενάση τύπου IV και θρυψίνη 0.25% σε EDTA. Ως θρεπτικά μέσα χρησιμοποι-ήθηκαν DNEM-HAMS F12, RPMI 1640 και το Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS).Από τον νεοπλασματικό ιστό και το υγιές παρέγχυμα τα κυτταρα διαχωρίστικαν, μέχρι την πλήρη διάσταση της μάζης, αδρανοποιήθηκαν κατάλληλακαι φιλτραρίστηκαν σε ειδικό ηθμό 70 μικρομέτρων, σύμφωνα με την μεθοδολογία του εργαστηρίου. Μετά από διαδοχικές φυγοκεντρήσεις, εκπλύσειςκαι εναιωρήσεις, τα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν με τριπλή φυγοκέντρηση113 στις 700 σ.α.λ. γιά 12΄. Η κυτταρική συγκομιδή και η βιωσιμότητα των απομονωθέντων ηπατοκυττάρων εκτιμήθηκε με Tryptan blue και 7-ΑΑD.Tόσο τα καρκινικά, όσο και τα υγιή ηπατοκύτταρα εναιωρήθηκαν εκ νέου και προστέθηκαν ανθρώπινη ινσουλίνη, μείγμα Pen/Strept, γενταμυκίνη και L-γλουταμίνη. Η απόδοση των ηπατοκυττάρων εκτιμήθηκε με καταμέτρηση κατά Neubauer. 2Χ10(5) ηπατοκύτταρα τοποθετήθηκαν σε 24 επικαλυμμένους δοκιμαστικούς σωλήνες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 48 ώρες. Ακολούθως αναρροφήθηκαν προσεκτικά και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα καλλιεργείας ηπατοκυττάρων για άλλες 16 ώρες για σταθεροποίηση. Η τελική μέτρηση έγινε με κυτταρομετρία ροής ηπατοκυττάρων.΄Ολα τα ηπατοκύτταρα καρκινικά και μή, όπως και τα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία συλλογής, έκπλυσης και φυγοκέντρη-σης, ώστε το ηπατικό ίζημα να δεχθεί τριπλή ανοσο-ιστοχημική χρώση με αντι-ανθρώπινη αλβουμίνη FITC και 7- αμινοακτινομυκίνη. Ακολούθησε επώαση, μονιμοποίηση και διάτρηση των κυτταρικών μεμβρανών. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία δωματίου και στο σκοτάδι, για 24, 48 και 72 ώρες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης και την μεθολογία του εργαστηρίου.Τα ηπατοκύτταρα αναγνωρίστηκαν με Hep-Par-1 από την κυτταρομετρία ροής και έγινε χρώση αιματοξυλίνης για την βαφή των πυρήνων. Τελικά παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο. Με ανοσο-ιστοχημική τεχνική, αναζητήθηκε η έκφραση του CD90 σε τομέςπαραφίνης, δειγμάτων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Χρησιμοποιήθηκε τοκεκαθαρμένο αντίσωμα CD90 (Thy-1) της affymetrix eBioscience, με αρ. Καταλόγου 14-0909, κλώνος eBio5E10 (5E10), σε συγκέντρωση 0,5 mg/ml καιμε Host/Isotype: mouse IgG1, Kappa, με αναμενόμενη μεμβρανική και κυτταροπλασμική χρώση. Επίσης με την ίδια τεχνική αναζητήθηκε η έκφραση του υποδοχέα Oct3/4 και CXCR4/CD 184.Οι συνεχείς μεταβλητές των ευρημάτων αναφέρονται σαν μέσος όρος μετυπικές αποκλίσεις. Οι συζευγμένες συγκρίσεις μεταξύ ποιοτικών μεταβλητών, έγιναν με την χρήση προσημασμένης δοκιμασίας Wilcoxon. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ H κυτταρική απόδοση υγρού ιστού μετά την κατεργασία με κολλαγενάση ήταν κατά μεγάλη προσέγγιση 7Χ10(6) για τα καρκινικά ηπατοκύτταρα και 5Χ10 (5) για τα υγιή. Αμέσως μετά την απομόνωση η μέση βιωσιμότητα ήταν 90% και 92% αντιστοίχως για τα καρκινικά και υγιή ηπατοκύτταρα. Τα κύτταρα από ΗΚΚ και τα υγιή ηπατοκύτταρα εξέφρασαν την αλβουμίνη σε επίπεδα 94% και 92% αντίστοιχα, όπως τεκμηριώθηκε με την χρήση κυτταρομετρίας ροής.Τα ανοσο-ιστοχημικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CD90(+) κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ανέδειξαν ογκογόνο (tumorigenic) ικανότητα, που αντίστοιχα δεν ανέδειξαν τα CD90(-) κύτταραΤο υγρό μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού OCT ¾ της Novocastra, με κωδικό ΝCL-L-OCT ¾, κλώνος Ν1ΝΚ, που χρησιμοποιήσαμε, στα αποτελέσματά μας είχαμε 10 περιπτώσεις με πολλά κύτταρα εντόνως θετικά, ενώ σε άλλες 5 περιπτώσεις παρατηρήσαμε ασθενώς θετικά κύτταρα και άλλη 1 με σπανιώτατα μεμονωμένα μετρίως θετικά.Το πολυκλωνικό αντίσωμα CD184/CXCR4 της ThermoFisher SCIENTIFIC,με αρ. Καταλόγου PA3-305, Host/Isotype:Rabbit που χρησιμοποιήσαμε, σε 9 περιπτώσεις μας εκφράσθηκε κυτταροπλασμικά σε πολλά από τα νεοπλασματικά κύτταρα και σε άλλες 6 εκφράσθηκε σε μεμονωμένα νεοπλασματικά κύτταρα. Σε όλες τις θετικές περιπτώσεις παρατηρήθηκε και θετική έκφρασή τουστους διαύλους του Ηering, προφανώς σε δυσδιάκριτα προγονικά/βλαστικάκύτταρα (stem/progenitor cells).Η αποκάλυψη των παραπάνω υποδοχέων στά νεοπλασματικά ηπατοκύτταρα, από ασθενείς με ΗΚΚ, (in vitro), ανιχνεύθησαν κοινοί με υποδοχείς στααρχέγονα καρκινικά ηπατοκύτταρα. Η παρατήρηση αυτή πιθανώς να αποτελέσει σημαντικό στοιχείο στην εξέλιξη της χημειοθεραπείας, με πιό στοχευμένη και εξειδικευμένη δράση, στις περιπτώσεις του ανθεκτικού μέχρι σήμερα ΗΚΚ.