Appendage regeneration in the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Abstract

Regeneration is the restoration of a body part after injury or as a normal bodilyprocess. Many animals are capable of regenerating different body parts. Salamandersregenerate their tail and legs, crabs regenerate their appendages, flatworms canregenerate their entire body, humans can regenerate part of their liver, etc. Thephylogenetic distribution of regenerative capacity in the animals is still unresolved.There are closely related species with very different regenerative capacities. Tounderstand how regeneration is achieved and how regenerative capacity evolved inthe Metazoa, we need to collect information from diverse species.Traditionally studied model organisms, such as flies, C. elegans and mice have poorregenerative capacities. On the other hand, animals with extended regenerativecapabilities, such as starfish, crabs, flatworms and salamanders, are not amenable togenetic manipulation. Parhyale hawaiensis is capable of regenerating all of itsappendages within approximately one week after amputation. Moreover, work fromour and other labs over the last ten years has developed a series of tools, renderingParhyale an attractive model for regeneration studies.The main goal of my PhD thesis was to establish Parhyale hawaiensis as the firstarthropod regeneration model organism. To achieve this, I described limbregeneration in Parhyale, I studied the level of commitment of progenitor cells thatgenerate the new tissue and identified a cell type that participates in muscleregeneration in Parhyale. I compared my findings with what is known in otherregeneration models to gain information about the evolutionary history of tissueregeneration.Initially, I identified that Parhyale is able to regenerate all of its appendages within 5-8 days, restoring all of the appendages’ cell types, such as epidermis, neurons andmuscles. I established a timeline of the process of appendage regeneration inParhyale, identifying five distinct stages. (a) Wound closure, (b) blastema formation,(c) patterning, (d) growth and (e) muscle regeneration.Animals that are capable of regeneration employ two very different strategies.Planarians use totipotent cells to regenerate their missing parts. On the other hand,vertebrates activate committed progenitors to regenerate specific tissues. To examinethe level of commitment of the progenitors during Parhyale limb regeneration, Igenerated mosaic animals expressing a fluorescent protein under the control of theheat-shock promoter in specific lineages. I subjected these animals to amputation andassessed the participation of the labeled cells in regeneration. I identified that theprogenitors are lineally restricted and reside locally, indicating the absence of a singlepool of progenitors. These experiments clearly indicate that Parhyale resemblesvertebrates in that it uses committed rather than totipotent progenitors.I also identified a Pax3/7-expressing mesodermal cell type closely attached to themuscle fibers. These cells were highly reminiscent of the muscle satellite cells thathave been described in vertebrates; therefore, I named them satellite-like cells (SLCs).Homologs of satellite cells had never been identified earlier outside the chordates.Satellite cells have been described in vertebrates to participate in muscle repair, growth and homeostasis. They are molecularly characterized by the expression of thePax3/7 family of transcription factors. Their participation in limb, fin and tailregeneration differs among species. By Edu staining and transplantation experiments,I was able to show that SLCs participate in the formation of the blastema, as well asin muscle formation during appendage regeneration.Collectively, these results highlight a number of key similarities in regenerationbetween arthropods and vertebrates, arguing for common cellular mechanisms thatwere present in their last common ancestor. Moreover, the discovery of SLCs inarthropods pushes back the origin of satellite cells to the last common ancestor ofprotostomes and deuterostomes, at the base of the bilaterians. This could imply thatthe ability to regenerate muscles has a common origin dating back to precambriantimes. Alternatively, muscle regeneration may have evolved independently inarthropods and vertebrates, engaging a homologous cell type – satellite cells – as thesource of regenerated muscles.

Η αναγέννηση αποτελεί μια φυσική διαδικασία για την αντιμετώπιση εξωτερικώνπροκλήσεων που απειλούν τη σωματική ακεραιότητα του οργανισμού. Πολλοίοργανισμοί αναγεννούν διαφορετικά μέρη του σώματός τους. Οι σαλαμάνδρεςαναγεννούν την ουρά και τα πόδια τους, τα καβούρια αναγεννούν τα άκρα τους, οιπλατυέλμινθες μπορούν να αναγεννήσουν οποιοδήποτε μέρος του σώματός τους, οιάνθρωποι αναγεννούν τμήμα του ήπατος κοκ. Η αναγεννητική ικανότητα ποικίλλειανάμεσα σε διαφορετικούς οργανισμούς. Υπάρχουν πολύ κοντινά είδη ζώων τα οποίαδιαφέρουν σημαντικά στην αναγεννητική τους ικανότητα. Για να καταλάβουμε πώςεπιτυγχάνεται η αναγέννηση και πώς εξελίχθηκε η αναγεννητική ικανότητα σταΜετάζωα, πρέπει να συλλέξουμε πληροφορίες από διαφορετικά είδη.Τα “κλασσικά” γενετικά συστήματα, όπως η Δροσόφιλα, ο νηματώδης C. elegansκαι το ποντίκι, παρουσιάζουν πολύ μικρή αναγεννητική ικανότητα. Αντίθετα, σεοργανισμούς στους οποίους παρατηρείται σημαντική αναγεννητική ικανότητα, όπωςστους αστερίες, στους πλατυέλμινθες, στα καρκινοειδή και στις σαλαμάνδρες, δενδιαθέτουμε ακόμα ανεπτυγμένα γενετικά εργαλεία για τη μελέτη της αναγέννησης.Τα τελευταία χρόνια ένα νέο πρότυπο γενετικό σύστημα – το καρκινοειδές Parhyalehawaiensis – έχει αναπτυχθεί, προσφέροντας νέες δυνατότητες για μελέτη τουφαινομένου της αναγέννησης. Ο Parhyale παρουσιάζει πλήρη αναγέννηση τωνάκρων εντός μίας εβδομάδας από την απόσπασή τους.Κύριος στόχος της διδακτορικής μου διατριβής ήταν η καθιέρωση του αμφιπόδουκαρκινοειδούς Parhyale hawaiensis ως μοντέλου για τη μελέτη της αναγέννησης. Σταπλαίσια της διδακτορικής μου διατριβής περιέγραψα τη διαδικασία της αναγέννησηςστον Parhyale. Στη συνέχεια, μελετήσα την προέλευση και την πλαστικότητα τωνπρογονικών κυττάρων που συμμετέχουν στην παραγωγή του νέου ιστού. Ακολούθως,μελέτησα την αναγέννηση των μυών, εντοπίζοντας έναν κυτταρικό τύπο που συμμετέχει στην αναγέννηση των μυών στον Parhyale.Αρχικά, έδειξα ότι ο Parhyale μπορεί και αναγεννά όλα τα άκρα του μέσα σε 5-8μέρες, αποκαθιστώντας όλους τους κυτταρικούς τύπους, όπως επιδερμίδα, νευρώνες και μύες. Διέκρινα πέντε στάδια στην αναγέννηση άκρων στον Parhyale: (α)Επούλωση της πληγής, (β) σχηματισμός βλαστήματος, (γ) μορφογένεση, (δ) αύξηση,(ε) αναγέννηση μυών.Διαφορετικά ζώα χρησιμοποιούν διαφορετικές στρατηγικές για να αναγεννήσουνμέρη του σώματός τους. Οι πλατυέλμινθες χρησιμοποιούν ολοδύναμα κύτταρα, ενώτα σπονδυλωτά χρησιμοποιούν διαφοροποιημένα προγονικά κύτταρα πουπαραμένουν δεσμευμένα στην αρχική τους ταυτότητα. Πραγματοποίησα ανάλυσηγενεαλογιών με χρήση μεταθετών στοιχείων και ανακάλυψα ότι τα προγονικάκύτταρα του Parhyale παραμένουν δεσμευμένα στην αρχική τους γενεαλογία καιβρίσκονται κοντά στον αναγεννώμενο ιστό. Η αναγέννηση, λοιπόν, στον Parhyaleομοιάζει σε αυτή των σπονδυλωτών και όχι των πλατυέλμινθων, όσον αφορά τηνπλαστικότητα των προγονικών κυττάρων.Ανακαλυψα επίσης ένα μεσοδερμικό τύπο κυττάρων που εκφράζει το μοριακό δείκτηPax3/7 στενά συνδεδεμένο με τις μυικές ίνες. Αυτά τα κύτταρα μοιάζουν σημαντικάμε τα μυικά δορυφορικά κύτταρα των σπονδυλωτών, γι’αυτό τα ονόμασα satellitelike cells. Κύτταρα ομόλογα των μυικών δορυφορικών κυττάρων δεν έιχαν βρεθείξανά σε μη χορδωτά.Τα δορυφορικά κύτταρα στα σπονδυλωτά συμμετέχουν στην αύξηση, επιδιόρθωσηκαι ομοιόσταση των μυών. Η συμμετοχή τους στην αναγέννηση διαφέρει ανάμεσαστα είδη. Με χρώση πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και πειράματα μεταμόσχευσης,έδειξα ότι αυτά τα κύτταρα στον Parhyale συμμετέχουν στο σχηματισμό τουβλαστήματος καθώς και στο σχηματισμό των μυών κατά την αναγέννηση.Τα αποτελέσματα της διατριβής μου καταδεικνύουν σημαντικές ομοιότητες στηδιαδικασία της αναγέννησης στα αρθρόποδα και τα σπονδυλωτά, προτείνονταςκοινούς κυτταρικούς μηχανισμούς παρόντες στον τελευταίο κοινό τους πρόγονο.Επίσης, η ανακάλυψη μυικών δορυφορικών κυττάρων στα αρθρόποδα υποδεικνύειτην πιθανή ύπαρξη μυικών δορυφορικών κυττάρων στον τελευταίο κοινό πρόγονοπρωτοστομίων και δευτεροστομίων. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι η ικανότητααναγέννησης μυών υπήρχε πριν την Κάμβρια περίοδο. Εναλλακτικά, η αναγέννησητων μυών μπορεί να εξελίχθηκε ανεξάρτητα στα δύο φύλα, χρησιμοποιώντας έναν ομόλογο κυτταρικό τύπο, τα μυικά δορυφορικά κύτταρα, ως πηγή τωναναγεννημένων μυων.