Επιδράσεις ηλεκτρομαγνητικών πεδίων σε βιολογικά συστήματα

Abstract

Electromagnetic waves (EMWs) ranging in frequency from 300 MHz to 300 GHz, areincreasingly present in our daily environment, for example, in microwave ovens, satelliteand radio/TV transmission, Wi-Fi, cellular-phone transmitters/receivers, cordless DECTtelephones, etc. Especially the intensive use of cellular mobile phones in the last 20 yearshas aroused concern about possible health problems that may be caused by this kind ofradiation. Non ionizing Radiofrequency (RF) microwave radiations used in mobiletelecommunications [systems: GSM-900MHz (Global System for MobileTelecommunications) and GSM/DCS-1800MHz (Digital Cellular System), which differin the carrier frequency] are always transmitted within pulses of extremely low frequency(ELF), or include ELF modulating signals in order to be able to carry and transmitinformation. The response of cells to different types of electromagnetic fields (EMFs) hasbeen demonstrated in various systems and conditions. The literature containscontroversial reports on the non thermal and non linear effects of RF-EMW on,mitochondria, apoptosis pathway, heat shock proteins, free radical metabolism, geneexpression, cell differentiation, DNA damage and the plasma membrane.Epidemiological and clinical studies have also expanded our knowledge. Among theeffect of RF-EMW on various body organs, possible effects on the brain is the mostresearched area and various effects of MWs from mobile phones on the central nervoussystem, including permeability of the blood–brain barrier (BBB), neuronal electricalactivity and increase in calcium ion efflux, neurotransmitter balance, cognitive function,increased incidence of brain tumors, have recently been reviewed. Recent studies suggestthat RF-EMW emitted from cell phones may be responsible for the induced increasedinfertility to humans, due to DNA damage and oxidative stress. Similar findings have emerged from studies in other organisms.It is worth mentioning that, differences in experimental outcomes are expected, since many factors could influence the outcome of experiments in the EMF research. Anyeffect of EMF has to depend on the energy absorbed by a biological organism and onhow the energy is delivered in space and time. Frequency, intensity, exposure duration,and the number of exposure episodes can affect the response, and these factors caninteract with each other to produce different effects.The experiments of the present thesis were conducted on newly emerged adultdipteran flies, Drosophila melanogaster. The life cycle of the insect is short andconcludes four stages: egg, larva, pupa, and adult. According to previous experiments ofour laboratory, a 6-min daily continuous exposure of the insects to GSM-900MHz(Global System for Mobile Telecommunications) signals under real exposure conditions,i.e. modulated by human voice, during the first 5 days of their adult life, brings about asignificant and non-thermal decrease in their reproductive capacity, as defined by thenumber of F1 pupae.In the present study we attempted to discover the cause of the observed reduction inthe reproductive capacity by examining 1) the cells of the egg chambers of alldevelopmental stages taken from the ovaries of the exposed insects to GSM fields ofcommercial cellular mobile phones (in vivo exposure) and 2) egg chambers, which wereexposed to GSM fields during their in vitro development. The intensity values used in theexposure systems were typical for digital mobile telephony handsets and they were allwithin the established exposure criteria [International Commission for Non-IonizingRadiation Protection (ICNIRP) 1998]. Moreover, we studied the influence of the abovementioned parameters of radiation exposure (intensity/power density, number ofepisodes, duration) on the biological outcome.Each Drosophila ovary is composed of approximately fifteen ovarioles, chains of developing egg chambers or follicles. Egg chambers are sixteen-cell germline cystssurrounded by up to a thousand somatic follicle cells. Early in egg chamber developmentwithin the region of germarium (the most anterior region of the ovariole) one of thegermline cells is specified to differentiate as an oocyte, and the remaining fifteen cellsdevelop as polyploid nurse cells. The nurse cells supply the oocyte with nutrients,organelles, mRNAs, and proteins needed throughout oogenesis and early embryonicdevelopment. The somatic follicle cells, which proliferate until stage 6, are required forproper axis specification of the oocyte and synthesis of yolk, vitelline membrane andchorion. Egg chambers move out of the germarium progressing through fourteen definedstages of oogenesis (early oogenesis st. 1-7, mid-oogenesis st. 8-10, late st. 11-14), wherea stage-14 oocyte is mature to be fertilized and oviposited.Programmed cell death (PCD) in the Drosophila ovary has been extensively studiedand occurs in response to both developmental and environmental stimuli, following twodifferent patterns, playing an integral role in the normal development of every oocyte.According to the first developmentally regulated and asynchronous pattern,physiological cell death commences at stage 11 in the nurse cells of every normallydeveloping follicle, with the rearrangement of the peri-nuclear actin-cytoskeleton and theformation of actin cables required for the process of dumping. At stage 12, chromatincondensation proceeds and ends with the DNA fragmentation of the nurse-cell nuclei atstage 13. The cell remnants are engulfed by the adjacent follicle cells that also diephysiologically at stage 14. The second pattern, which is sporadically observed at stages7–8 (before vitellogenesis) and in region 2 in the germarium, is induced in response todifferent stress stimuli and it is marked simultaneously by the condensed, fragmentednurse-cell and follicle-cell nuclei and the disorganized actin network of the abnormalfollicles. Stages 7–8 and the region 2 within the germarium are the two checkpoints thatprovide a protective mechanism in the process of oogenesis: they remove defective egg chambers that are unable to develop into fertile eggs, thus preventing the waste ofprecious nutrients.According to the experimental protocols we placed flies that emerged within 4 h,males and females separately, in cylindrical glass vials containing standard fly food. Theinsects were kept there for 2 days. The third day, when both female and male insects aresexually mature, they were transferred into a common vial with fresh food, one vial foreach group, where they were kept for another 3 days, a period in which female insectsprovide the maximum of their oviposition.The exposure of the flies took place during the above mentioned 5 days according tothe exposure system and protocol of each section. On the sixth day there was anadditional last exposure and 3 h later the parent flies were removed from the vials. Thevials with the developing embryos were kept in the culture room for another 6–8 days, inorder to count the number of F1 pupae developed in each vial. Removed maternal fliesobtained from the above procedure were then anaesthetized and their ovaries weredissected and separated into single follicles in Ringer’s solution. The follicles were thenincubated and treated with the appropriate staining for the detection of the following celldeath features: DNA fragmentation, actin-cytoskeleton disorganization, chromatincondensation and caspase activation. Specimens were then examined underfluorescence/CLSM microscope. Samples were also prepared for observation undertransmission electron microscope.In the case of the in vitro study, we examined the actin cytoskeleton organization and distribution in the egg chamber cells after their in vitro development in Schneider'smedium and the simultaneously exposure to the GSM field.The experimental sections are the following:1) The effect of GSM exposure on DNA and actin cytoskeleton-Comparison betweenthe continuous and the four different patterns of intermittent exposure2) The induced apoptotic cell death by GSM exposure on the egg chamber cells of theearly and mid-oogenesis3) The effect of GSM exposure on the egg chambers of the late stages of oogenesis4) The effect of GSM exposure on the egg chambers during their in vitrodevelopment.which demonstrated:1) That all types of exposure resulted in a significant decrease of the reproductivecapacity, up to 43%, and induction of DNA fragmentation and actin cytoskeletonalterations (up to 46% and 44% respectively) in the egg chamber cells of the early andmid-oogenesis (st. 1-10). Both cell death features were found to coincide in the samecells of the defective follicles. Intermittent exposures with 10-min intervals betweenexposure sessions proved to be almost equally effective as continuous exposure of thesame total duration, an evidence for cumulative effects of radiation. On the contrary,longer intervals (6h) between different doses allowed insects to recover from the stress of exposure to radiation, providing some evidence for the activation of a cell survivalresponse.2) The detection of additional signs of cell death, cytoplasmic caspase activation andchromatin condensation, in the egg chamber cells of the early and mid-oogenesis, in theorder of 30%. Nurse cell nuclei were found both fragmented and condensed. Τhedifference between the percentages recorded in this section in comparison to the preceding one can be attributed to the lower power density of the applied field.3) That the 6min/day GSM exposure has no effect on the programmed cell death ofthe nurse cells (st.12-13), the dumping process (st. 11), and the endogenous peroxidaseactivity (st. 14). However, examining egg chambers after the 30min/day exposure of theinsects, again during the first 6 days of their adult life, we observed that GSM exposureaffected the integrity of the follicular epithelium (st. 12-13) as well as the shape of theoocyte (st. 14).4) Finally, our results indicated that 3h (45min on/15min off) GSM exposure of theegg chambers during their in vitro development causes significant defects in the actincytoskeleton organization and distribution in their nurse and follicle cells and affects thedumping process.The above observations strongly suggest that, at least apoptosis is one kind of celldeath induced by mobile phone radiation (6min/day x 6 days) in the present biologicalsystem, being responsible for the degeneration of the egg chambers detected at alldevelopmental stages of the early and mid-oogenesis. However, the induction of othertypes of cell death, for example necrotic, can not be excluded. The egg chambers of thetwo checkpoints showed the highest sensitivity against this kind of stress with theapoptotic features mainly provided by their nurse cells. Moreover, the percentages of thedegenerative follicles were similar to those of the reduction in the reproductive capacity;therefore we assume that the induced cell death in the egg chamber cells is the maincause for the decreased number of F1 pupae.The origin of the follicular discontinuities, associated with GSM exposure, may beattributed to the failure of sufficient follicle cell division or the induced follicle cell death.An alternate explanation could be the GSM effect on the adhesive properties of the cells. Finally, the effect of GSM exposure on the actin cytoskeleton and the dumping process inthe in vitro study could be attributed to the oxidation of actin or changes in the proteinactivity, which interact with the actin cytoskeleton, due to oxidation or changes in theintracellular Ca+2 concentration. The same explanation can be given for the observedchange in the shape of the oocyte.At the cellular level, the interaction between EMFs and cell membranes is a possibleinterpretation of the observed biological effects, according to the Ion Forced-VibrationTheory proposed by our laboratory. More specifically, the irregular gating ofelectrosensitive membrane ion channels (for example Ca+2 channels) due to theirinteraction with the ELF components of mobile phone signals may lead, to disruption ofthe cell’s electrochemical balance and consequently to mitochondrial/lysosomaldysfunction and ROS overproduction, able to affect many aspects of the nurse/folliclecell death mechanism.However, the link between RF-EMF exposure and changes in intracellular ionconcentration, oxidative stress, and alterations in the cell function merits furtherinvestigation.

Στη σύγχρονη εποχή της τεχνολογίας, ο άνθρωπος ζει μέσα σε ένα περιβάλλονβεβαρημένο από ποικίλες πηγές τεχνητών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων (ΗΜΠ) ενόςευρέος φάσματος συχνοτήτων, 300MHz-3GHz. Ορισμένα παραδείγματα αποτελούν: οιφούρνοι μικροκυμάτων, οι κεραίες δορυφορικών επικοινωνιών και ραδιοτηλεόρασης, ταασύρματα συστήματα δικτύου Wi-Fi, οι πομποί και δέκτες της κυψελωτής κινητήςτηλεφωνίας, τα ασύρματα τηλέφωνα DECT κ.ά. Ειδικά η εκτεταμένη χρήση τωνκυψελωτών κινητών τηλεφώνων, τις δύο τελευταίες δεκαετίες, έχει προκαλέσει τοιδιαίτερο ενδιαφέρον, αλλά και την ανησυχία της επιστημονικής κοινότητας σχετικά μετους πιθανούς κινδύνους που μπορεί να κρύβει αυτή η παγιωμένη πλέον συνήθεια τηςκαθημερινότητας του σύγχρονου ανθρώπου. Η μη ιονίζουσα ακτινοβολία τωνραδιοσυχνοτήτων (RF), που χρησιμοποιεί η τεχνολογία των κινητών τηλεπικοινωνιών[συστήματα GSM-900 MHz (Global System for Mobile Telecommunications) καιGSM/DCS-1800MHz (Digital Cellular System) με διαφορά στη φέρουσα συχνότητα]μεταδίδεται με παλμούς πολύ χαμηλών συχνοτήτων 217 Hz (ELF), ή περιλαμβάνεισήματα διαμόρφωσης σε συχνότητες ELF, για τη μεταφορά και μετάδοση τηςπληροφορίας. Ερευνητικές μελέτες, σε πλήθος βιολογικών συστημάτων και συνθηκώνέκθεσης, διερευνούν τον τρόπο απόκρισης των κυττάρων/οργανισμών στα διάφορα είδηηλεκτρομαγνητικών (H/M) πεδίων. Η βιβλιογραφία περιλαμβάνει αντικρουόμενααποτελέσματα σχετικά με τις μη-θερμικές και μη-γραμμικές επιδράσεις της RFακτινοβολίας των κινητών τηλεφώνων στα μιτοχόνδρια, το αποπτωτικό μονοπάτι, τιςπρωτεϊνες θερμικού σοκ, το μεταβολισμό των ελευθέρων ριζών, τη γονιδιακή έκφραση,την κυτταρική διαφοροποίηση, το γενετικό υλικό, και τις πλασματικές μεμβράνες, ενώδεδομένα έχουν προκύψει τόσο από επιδημιολογικές μελέτες όσο και από κλινικέςδοκιμές. Ένας μεγάλος όγκος δεδομένων, όπως θα περίμενε κανείς, έχει συσσωρευθείκαι αφορά στις ενδεχόμενες αλλοιώσεις της εγκεφαλικής λειτουργίας,συμπεριλαμβανομένων της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, τηςνευρωνικής ηλεκτρικής δραστηριότητας και της αυξημένης εκροής ιόντων ασβεστίου,της ισορροπίας των νευροδιαβιβαστών, της γνωστικής λειτουργίας, και των αυξημένωνκρουσμάτων εγκεφαλικών όγκων. Πρόσφατες επίσης έρευνες κάνουν λόγο για τηναυξημένη πιθανότητα υπογονιμότητας στον ανθρώπινο πληθυσμό εξαιτίας της βλάβηςστο DNA και του επαγομένου από την ακτινοβολία οξειδωτικού στρες. Σε παρόμοιασυμπεράσματα έχουν καταλήξει αντίστοιχες μελέτες σε άλλους οργανισμούς.Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι, η ασυμφωνία πολλές φορές ανάμεσα σταευρήματα των πειραματικών μελετών, στο συγκεριμένο ερευνητικό πεδίο, είναιαναμενόμενη και αναπόφευκτη, καθώς το παρατηρούμενο βιολογικό αποτέλεσμα μπορείνα επηρεαστεί από ένα πλήθος παραγόντων. Η βιολογική επίδραση εξαρτάται από τοποσό της ενέργειας που απορροφάται από τον κάθε οργανισμό, καθώς και από τον τρόποπου αυτή κατανέμεται στο χώρο και το χρόνο. Η συχνότητα, η ένταση, η διάρκειαέκθεσης και ο αριθμός δόσεων της ακτινοβολίας μπορούν να επηρεάσουν την κυτταρικήαπόκριση, ενώ ο συνδυασμός και η αλληλεπίδραση των παραπάνω παραγόντωνδιαμορφώνει το τελικό βιολογικό αποτέλεσμα.Τα πειράματα της παρούσας διατριβής διεξήχθησαν σε νεοεκδυθέντα δίπτερα έντομαDrosophila melanogaster. Ο κύκλος ζωής του εντόμου είναι σύντομος και περιλαμβάνειτέσσερα διακριτά στάδια: το αυγό, την προνύμφη, τη χρυσαλίδα και το ενήλικο άτομο. Σύμφωνα με τα ευρήματα προηγουμένων μελετών του εργαστηρίου μας, η συνεχήςημερήσια έκθεση διάρκειας 6 λεπτών του εντόμου στη διαμορφωμένη, από τηνανθρώπινη ομιλία, ακτινοβολία του συστήματος GSM-900MHz, κατά τη διάρκεια τωνπρώτων 5 ημερών της ενήλικης ζωής του, προκαλεί σημαντική μη-θερμική μείωση τηςαναπαραγωγικής του ικανότητας/μέσης ωοτοκίας, όπως αυτή προσδιορίζεται από τοναριθμό χρυσαλίδων της πρώτης θυγατρικής γενιάς.Η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στη διερεύνηση, σε κυτταρικό επίπεδο, τηςαιτίας, που ευθύνεται για την παρατηρούμενη μείωση της αναπαραγωγικής ικανότηταςτων εντόμων. Για το σκοπό αυτό, εξετάστηκαν: 1) ωοθυλάκια όλων των αναπτυξιακώνσταδίων προερχόμενα από ωοθήκες εκτεθειμένων εντόμων (in vivo έκθεση) και 2)ωοθυλάκια εκτεθειμένα κατά την in vitro ανάπτυξή τους, στα GSM πεδία κοινώνκινητών τηλεφώνων. Η έκθεση των εντόμων πραγματοποιήθηκε σε τιμές έντασης εντόςτων θεσπισμένων ορίων από τη διεθνή επιτροπή για την προστασία από τη μη-ιονίζουσαακτινοβολία (ICNIRP, 1998), Παράλληλα, μελετήθηκαν ορισμένες παράμετροι τηςακτινοβολίας (αριθμός δόσεων, διάρκεια και ένταση) ως προς τον τρόπο που αυτέςκαθορίζουν το τελικό βιολογικό αποτέλεσμα.Η κάθε ωοθήκη του εντόμου αποτελείται από 18-20 ωοθηκάρια, παράλληλες δηλαδήσειρές ωοθυλακίων διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων. Τα ωοθυλάκια είναιγενετικές/βλαστικές κύστεις, 16 κυττάρων που περιβάλλονται από περίπου 1000σωματικής προέλευσης θυλακοκύτταρα. Στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης τουωοθυλακίου, που διεξάγονται στην περιοχή του γερμαρίου (την πλέον πρόσθια περιοχήτου ωοθηκαρίου), ένα από τα βλαστικά κύτταρα διαφοροποιείται σε ωοκύτταρο, ενώ ταυπόλοιπα 15 αναπτύσσονται και συνιστούν τα πολυπλοειδικά τροφοκύτταρα. Τατελευταία τροφοδοτούν το ωοκύτταρο με θρεπτικά συστατικά, οργανίδια, mRNAs,πρωτεϊνες, που απαιτούνται για τη διεξαγωγή της ωογένεσης, αλλά και την ανάπτυξη τουεμβρύου. Ο πληθυσμός των σωματικών θυλακοκυττάρων, που υπόκειται σε μιτωτικέςδιαιρέσεις μέχρι και το αναπτυξιακό στάδιο 6, απαιτείται για την εγκαθίδρυση τωναξόνων πολικότητας στο ωοκύτταρο, για τη σύνθεση της λεκίθου, της βιτελλινήςμεμβράνης και του χορίου. Τα ωοθυλάκια καθώς εξέρχονται από το γερμάριο, καιεισέρχονται στο βιτελλάριο, αναπτύσσονται μέσα από μία σειρά 14 διακριτών σταδίων(πρώιμης ωογένεσης στ. 1-7, μέσης στ.8-10, όψιμης στ. 11-14), με το ωοκύτταρο τουσταδίου 14 να είναι ώριμο για γονιμοποίηση και απόθεση.Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (ΠΚΘ) είναι ιδιαίτερα μελετημένος καιπαρατηρείται ως απόκριση τόσο σε ενδογενή (αναπτυξιακά) όσο και σε εξωγενή (από τοπεριβάλλον) ερεθίσματα ακολουθώντας δύο διαφορετικά πρότυπα με καθοριστικό ρόλοστη φυσιολογική ανάπτυξη των ωοθυλακίων.Σύμφωνα με το αναπτυξιακά ρυθμιζόμενο και ασύγχρονο πρότυπο, ο φυσιολογικός,με ορισμένα χαρακτηριστικά απόπτωσης, θάνατος, αρχίζει στο στάδιο 11 στατροφοκύτταρα του κάθε αναπτυσσομένου ωοθυλακίου με την χαρακτηριστικήαναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης πέριξ των πυρήνων και τοσχηματισμό των δεσμών ακτίνης, που απαιτούνται για τη διεξαγωγή της διαδικασίαςαδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικού στο ωοκύτταρο. Στο στάδιο 12, η πυρηνικήχρωματίνη συμπυκνώνεται, ενώ ακολουθεί ο θρυμματισμός του DNA κατά το στάδιο 13.Τα υπολείμματα των τροφοκυττάρων εγκολπώνονται και απομακρύνονται από ταγειτονικά θυλακοκύτταρα, τα οποία επίσης υφίστανται κυτταρικό θάνατο στο στάδιο 14.Το δεύτερο πρότυπο παρατηρείται σποραδικά στα στάδια 7-8 (πριν την βιτελλογένεσητης μέσης ωογένεσης) και στο στάδιο του γερμαρίου και συνιστά απόκριση απέναντι σεδιάφορα στρεσογόνα ερεθίσματα, ενώ χαρακτηρίζεται από την ταυτόχρονη ανίχνευσητων συμπυκνωμένων και θρυμματισμένων πυρήνων των τροφοκυττάρων και των θυλακοκυττάρων, όπως και από το αποδιοργανωμένο δίκτυο ακτίνης στα ανώμαλαωοθυλάκια. Το γερμάριο και τα στάδια 7-8 θεωρούνται τα δύο σημεία ελέγχου τηςωογένεσης και δρουν ως ένα είδος προστατευτικού μηχανισμού της αναπτυξιακήςδιαδικασίας για τον περιορισμό της απώλειας ενέργειας και θρεπτικών υλικών σεωοθυλάκια ανίκανα να αναπτυχθούν σε φυσιολογικά ώριμα αυγά.Σύμφωνα με τα πειραματικά μας πρωτόκολλα, νεοεκδυθέντα έντομα πουσυλλέχθησαν εντός 4 ωρών, τοποθετούνται σε σωλήνες με τροφή, χωριστά τα αρσενικάαπό τα θηλυκά, όπου και παραμένουν για τις επόμενες 2 μέρες. Με την ολοκλήρωση του2ου 24ωρου τα έντομα είναι σεξουαλικά ώριμα και τοποθετούνται σε νέους κοινούςσωλήνες έτοιμα για διασταύρωση. Σε αυτούς παραμένουν για 3 ακόμη 24ωρα κατά τηδιάρκεια των οποίων τα θηλυκά παρουσιάζουν το μέγιστο της ωοτοκίας τους.Η έκθεση των εντόμων έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια των παραπάνω 5 24ώρωνσύμφωνα με τα πρωτόκολλα έκθεσης της κάθε πειραματικής ενότητας. Το 6ο 24ωροπραγματοποιείται μία επιπλέον έκθεση και 2-3 ώρες αργότερα τα πατρικά έντομααπομακρύνονται από τους σωλήνες, οι οποίοι φυλάσσονται σε θάλαμο σταθερώνσυνθηκών για τα επόμενα 6-8 24ωρα, μέχρι δηλαδή την ανάπτυξη των θυγατρικώνχρυσαλίδων. Στις ωοθήκες των θηλυκών εντόμων, που απομακρύνθηκαν από τουςσωλήνες, κάνουμε ανατομία σε ισότονο με την αιμολέμφο των εντόμων διάλυμαRinger’s προκειμένου να λάβουμε τα ωοθυλάκιά τους. Τα διαχωρισμένα ωοθυλάκιαεπωάζονται στη συνέχεια με την κατάλληλη χρώση για την ανίχνευση των ακόλουθωνχαρακτηριστικών κυτταρικού θανάτου: αποδόμηση DNA, αποδιοργάνωση τουκυτταροσκελετού της ακτίνης, συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης καιενεργοποίησης κασπασών. Η εξέταση των δειγμάτων γίνεται σε μικροσκόπιο φθορισμούή συνεστιακό μικροσκόπιο laser (CLSM). Ορισμένα δείγματα εξετάστηκαν και μετά από έγκλειση, τομές και χρώση στο φωτονικό μικροσκόπιο και ηλεκτρονικό μικροσκόπιοδιέλευσης.Στην περίπτωση της in vitro μελέτης, εξετάστηκε η οργάνωση και κατανομή τουκυτταροσκελετού της ακτίνης σε απομονωμένα ωοθυλάκια, που προήλθαν από την invitro ανάπτυξή τους για 3h σε θρεπτικό μέσο Schneider's και την ταυτόχρονη έκθεσήτους στην GSM ακτινοβολία.Οι πειραματικές ενότητες που εξετάστηκαν είναι οι ακόλουθες:1) Επίδραση της GSM ακτινοβολίας στο DNA και τον κυτταροσκελετό της ακτίνης-σύγκριση βιολογικής επίδρασης συνεχούς και διακοπτόμενης έκθεσης,2) Επαγωγή χαρακτηριστικών αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου στα ωοθυλάκια τηςπρώιμης και μέσης ωογένεσης από την GSM ακτινοβολία3) Επίδραση της GSM-ακτινοβολίας στα ωοθυλάκια της όψιμης ωογένεσης4) Επίδραση της GSM-ακτινοβολίας στην in vitro ανάπτυξη των ωοθυλακίωνκαταδεικνύοντας τα εξής:1) Τα αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης αποδομημένου DNA και τις αλλοιώσεις στονκυτταροσκελετό της ακτίνης (έως 46% και 44% αντιστοίχως) από όλους τους τύπουςέκθεσης στα κύτταρα ωοθυλακίων της πρώιμης και μέσης ωογένεσης (στ. 1-10) λόγω τηςέκθεσης στην GSM ακτινοβολία (6min/day). Και τα δύο χαρακτηριστικά κυτταρικούθανάτου βρέθηκαν να συμπίπτουν στα ίδια κύτταρα των εκφυλισμένων ωοθυλακίων.Παράλληλα, διαπιστώθηκε η σημαντική μείωση της μέσης ωοτοκίας μέχρι το ποσοστότου 43%. Οι διακοπτόμενοι τύποι με τα σύντομα διαλείμματα (10 λεπτών) μεταξύ των δόσεων της ακτινοβολίας αποδείχθηκαν στον ίδιο σχεδόν βαθμό δραστικοί με τον συνεχή τρόπο έκθεσης ίδιας συνολικής διάρκειας, παρέχοντας μία ένδειξη αθροιστικήςεπίδρασης της συγκεκριμένης ακτινοβολίας. Αντιθέτως, τα μεγαλύτερα διαστήματαδιακοπής (6 ωρών) επέτρεψαν στα έντομα να ανακάμψουν από το στρες της έκθεσηςενδεχομένως λόγω ενεργοποίησης κάποιου μηχανισμού κυτταρικής επιβίωσης αντίθανάτου.2) Την ανίχνευση επιπροσθέτων χαρακτηριστικών κυτταρικού θανάτου, όπως ηενεργοποίηση των κασπασών στο κυτταρόπλασμα των τροφοκυττάρων και ησυμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης, στα κύτταρα ωοθυλακίων της πρώιμης καιμέσης ωογένεσης (στ. 1-10), σε ποσοστά της τάξεως του 30%. Σημειώνεται ότι, ησυμπυκνωμένη πυρηνική χρωματίνη βρέθηκε να συνυπάρχει με το θρυμματισμένο DNAστους ίδιους τροφοκυτταρικούς πυρήνες. Η διαφορά που καταγράφηκε στα ποσοστά τηςπαρούσας σε σύγκριση με τα ποσοστά της προηγούμενης ενότητας μπορεί να αποδοθείστη χαμηλότερη τιμή έντασης της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας από το κινητό τηλέφωνοστην οποία έλαβε χώρα η έκθεση των εντόμων.3) Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής, η έκθεση των εντόμων στηνGSM ακτινοβολία (6min/day) δεν προκάλεσε μεταβολές: 1) στον ΠΚΘ τωντροφοκυττάρων (στ. 12-13) και τη διαδικασία αδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικούστο ωοκύτταρο (στ. 11) και 2) στην ενδογενή ενεργότητα της υπεροξειδάσης τουκελύφους (στ. 14). Ωστόσο, δύο τύπου αλλοιώσεις διαπιστώθηκαν μετά την έκθεση τωνεντόμων μεγαλύτερης ημερήσιας διάρκειας (30min/day). Στην περίπτωση αυτή υπήρξανενδείξεις ότι η GSM έκθεση επηρεάζει την ακεραιότητα του επιθηλίου τωνθυλακοκυττάρων (στ. 12-13) με την παρουσία ασυνεχειών σε αυτό, ενώ μεταβολές διαπιστώθηκαν και στο σχήμα του ωοκυττάρου (συρρίκνωση) (στ. 14).4) Τέλος, η GSM έκθεση [3h (45min on/15min off)] απομονωμένων ωοθυλακίωνσταδίου 11 σε in vitro συνθήκες, επιφέρει μεταβολές στην οργάνωση και την κατανομήτου δικτύου ακτίνης στα τροφοκύτταρα και τα θυλακοκύτταρα και κατ’επέκταση στηδιαδικασία αδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικού στο ωοκύτταρο (dumping).Σύμφωνα με τα παραπάνω ευρήματα, η απόπτωση είναι ένα τουλάχιστον είδοςκυτταρικού θανάτου που επάγεται, από την έκθεση των εντόμων στην GSM ακτινοβολία(6min/day) των κινητών τηλεφώνων, στα κύτταρα των ωοθυλακίων όλων των σταδίωντης πρώιμης και μέσης ωογένεσης. Ωστόσο, η πιθανότητα η ακτινοβολία να επηρεάζεικαι μηχανισμούς άλλων τύπων κυτταρικού θανάτου, όπως της νέκρωσης, δεν θαμπορούσε να αποκλειστεί. Μεγαλύτερη ευαισθησία όπως ήταν αναμενόμενο, επέδειξαντα ωοθυλάκια στα δύο σημεία ελέγχου της ωογένεσης, στο γερμάριο και τα στάδια 7-8με τα τροφοκύτταρα να είναι αυτά στα οποία κυρίως ανιχνεύονται τα χαρακτηριστικάτου επαγομένου κυτταρικού θανάτου. Επιπλέον, σημαντική υπήρξε η διαπίστωση ότι ταποσοστά που προήλθαν από την εφαρμογή και των δύο πειραματικών πρωτοκόλλων(αναπαραγωγικής ικανότητας και ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου) στις ίδιες ομάδεςεντόμων σχεδόν ταυτίζονται, και άρα συνάγεται το συμπέρασμα ότι, ο επαγόμενοςκυτταρικός θάνατος των τροφοκυττάρων/θυλακοκυττάρων, που καταλήγει στονεκφυλισμό των ωοθυλακίων, είναι ο κυρίως υπεύθυνος για την παρατηρούμενη μείωσητης μέσης ωοτοκίας του εντόμου. Άλλωστε, στο συμπέρασμα αυτό μπορούμε νακαταλήξουμε και από το γεγονός ότι, τα ωοθυλάκια των σταδίων 11-13 παρουσίασανφυσιολογική ανάπτυξη (6min/day). Αντιθέτως, οι ασυνέχειες στο επιθήλιο τωνθυλακοκυττάρων, που διαπιστώθηκαν στην περίπτωση της έκθεσης μεγαλύτερηςχρονικής διάρκειας (30min/day), θα μπορούσαν να αποδοθούν στον επαγόμενο θάνατο των θυλακοκυττάρων, σε μεταβολές κατά τις διαδικασίες των μιτωτικών τους διαιρέσεων(στάδια 1-6), είτε τέλος σε μεταβολές των συνιστωσών κυτταρικής πρόσφυσης. Τέλος,τα δεδομένα αλλοίωσης του δικτύου ακτίνης in vitro είναι δυνατόν να οφείλονται στην οξείδωση της ακτίνης ή την αλλαγή ενεργότητας πρωτεϊνικών μορίων που σχετίζονται μεαυτή, λόγω οξείδωσης ή μεταβολών στις ιοντικές συγκεντρώσεις ασβεστίου. Αντίστοιχηερμηνεία μπορεί να δοθεί και στην περίπτωση συρρίκνωσης του ωοκυττάρου.Σε επίπεδο κυττάρου, οι παρατηρούμενες βιολογικές επιδράσεις μπορούν νααποδοθούν στην αλληλεπίδραση των Η/Μ πεδίων με τις κυτταρικές μεμβράνες,σύμφωνα με τον προταθέντα βιοφυσικό μηχανισμό του εργαστηρίου μας. Πιοσυγκεκριμένα, το αντικανονικό άνοιγμα/κλείσιμο των ηλεκτροευαίσθητωνδιαμεμβρανικών ιοντικών καναλιών (π.χ. κανάλια Ca+2), λόγω της εξαναγκασμένηςταλάντωσης, που υφίστανται τα ελεύθερα ιόντα που βρίσκονται σε μεγάλεςσυγκεντρώσεις εκατέρωθεν των μεμβρανών, από τις ELF συνιστώσες των σημάτων τωνκινητών τηλεφώνων, μπορεί να ανατρέψει την ηλεκτροχημική ισορροπία του κυττάρουκαι κατ’επέκταση να προκαλέσει δυσλειτουργία στα μιτοχόνδρια ή τα λυσοσώματα,καθώς και υπερπαραγωγή ενεργών ενώσεων οξυγόνου (ROS), μεταβολές ικανές ναεπηρεάσουν τους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου των τροφοκυττάρων και τωνθυλακοκυττάρων των ωοθυλακίων.Ωστόσο, η σύνδεση ανάμεσα στη δράση των RF H/M πεδίων και τις επερχόμενεςαλλαγές των ενδοκυτταρικών ιοντικών συγκεντρώσεων, το οξειδωτικό στρες και τιςμεταβολές της κυτταρικής λειτουργίας χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.