Παραγωγή κυτταροκινών από το ολικό αίμα υγιών ενηλίκων και ασθενών μετά από διέγερση με λιποτειχοϊκό οξύ και πεπτιδογλυκάνη

Abstract

Introduction: Various studies have shown an altered immunological reaction of patients vulnerable to infections, using an ex-vivo model of whole blood stimulation by endotoxin. The aim of our study was to assess the baseline immune status of patients susceptible to infection and their immunological reaction using molecules of gram-positive bacteria as immunostimulants.Materias and methods: During the first part of the study, blood was taken from 8 healthy individuals, in order to construct the dose-response and time-response curves of Lipoteichoic acid (LTA) and Peptidoglycan (PepG) molecules. The best incubation time was determined at 8 hours, and the optimum doses proved to be 1 μg/ml of LTA and 10 μg/ml of PepG.During the second part of the study blood was taken from 10 healthy volunteers, 10 patients with End Stage Renal Disease (ESRD) just before hemodialysis, 10 patients with Diabetes Mellitus (DM) and glycosylated hemoglobin >6.5% and 10 patients on their 2nd day of stay in the Intensive Care Unit (ICU), who suffered non septic SIRS and had an APACHE II score ≥25. After appropriate preparation aliquots of 1 ml were incubated with 1 μg/ml LTA for an incubation period of 8 h and supernatants were collected and stored at -20 °C until the measurements of the cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β and IL-10, using ELISA. The results are presented as mean values ±SEM, the variation of each cytokine per cohort was assessed by Student's t-test and the differences among the four groups were tested using one-way A-NOVA adjusted for multiple comparisons by the Tukey test. For the data analysis, the statistical program Graph Pad 4.0 was used.Results: All patient groups had higher baseline values of TNF-α, IL-6, IL-1β, and IL-10 compared to the control group, but only for the ICU patients the difference was statistically significant. The ratio IL-10/IL-6 was found 0.22, 0.51 and 1.24 in healthy persons, ESRD and DM patients, respectively, and 2.46 in ICU patients. In all examined groups, the levels of cytokines increased significantly after stimulation with LTA, although in severely ill patients this change was considerably smaller. Conclusions: Chronic renal failure and diabetic patients are in a proinflammatory state. Severely ill patients are in a mixed proinflammatory / antiinflammatory state with elevated values of both proinflammatory and antinflammatory cytokines and an elevated IL-10/IL-6 ratio. The response of ESRD and DM patients to LTA was adequate and equivalent to that of healthy persons, whereas ICU patients showed a blunted response, possibly due to their underlying relative immunoparalysis.

Εισαγωγή: Υπάρχουν μελέτες που καταδεικνύουν διαταραγμένη ανοσιακή απάντηση διαφόρων ομάδων ασθενών ευπαθών σε λοιμώξεις, οι οποίες στηρίζονται σε διέγερση του ανοσιακού συστήματος με ενδοτοξίνη των gram-αρνητικών μικροβίων. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της βασικής ανοσολογικής κατάστασης ασθενών ευπαθών σε λοιμώξεις και της ανοσολογικής τους αντίδρασης, μετά διέγερση με συστατικά του τοιχώματος των gram-θετικών μικροβίων.Υλικό-Μέθοδος: Κατά την αρχική φάση της μελέτης ελήφθη αίμα από 8 υγιείς εθελοντές και διαμορφώθηκαν οι καμπύλες δόσης-απόκρισης και χρόνου-απόκρισης με εφαρμογή διαφόρων δόσεων λιποτειχοϊκού οξέος (LTA) και πεπτιδογλυκάνης (PepG), για ποικίλα χρονικά διαστήματα. Ο βέλτιστος χρόνος επώασης ήταν 8 ώρες και η βέλτιστη δόση του LTA 1 μg/ml, ενώ της PepG 10 μg/ml.Στη δεύτερη φάση της μελέτης ελήφθη αίμα από 10 υγιείς εθελοντές, 10 αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ αμέσως προ της συνεδρίας αιμοκάθαρσης, 10 ασθενείς με ΣΔ τύπου ΙΙ και τιμή γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης >6,5% και 10 βαριά πάσχοντες ασθενείς στη δεύτερη ημέρα νοσηλείας τους, που εμφάνιζαν SIRS μη σηπτικής αιτιολογίας και είχαν APACHE II score ≥ 25. Κατόπιν κατάλληλης επεξεργασίας τα δείγματα επωάσθηκαν με 1 μg LTA για 8 ώρες και διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία -20οC μέχρι τη μέτρηση των κυτταροκινών TNF-α, IL-6, IL-1β και IL-10 με μέθοδο ELISA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM, η μεταβολή της κάθε κυτταροκίνης ανά ομάδα ασθενών εκτιμήθηκε με Student’s t-test και οι διαφορές μεταξύ των τεσσάρων ομάδων με δοκιμασία A-NOVA προσαρμοσμένη για πολλαπλές συγκρίσεις κατά το Tukey test. Για την ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Graph Pad 4.0.Αποτελέσματα: Οι βασικές τιμές των κυτταροκινών στις τρεις ομάδες ασθενών ήταν αυξημένες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, όμως μόνο για την ομάδα των βαριά πασχόντων η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική. Ο λόγος IL-10/IL-6 βρέθηκε ήταν 0,22, 0,51 και 1,24 στους υγιείς εθελοντές, ESRD και DM ασθενείς, αντίστοιχα, και 2,46 στους ασθενείς της ΜΕΘ. Σε όλες τις ομάδες εξετασθέντων τα επίπεδα των κυτταροκινών αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη διέγερση με LTA, αν και στους βαριά πάσχοντες η μεταβολή ήταν αρκετά μικρότερη. Συμπεράσματα: Οι χρόνιοι νεφροπαθείς και οι σακχαροδιαβητικοί ασθενείς βρίσκονται σε προφλεγμονώδη κατάσταση, ενώ στους βαριά πάσχοντες ασθενείς ελέγχεται μικτή προφλεγμονώδης-αντιφλεγμονώδης αντίδραση με αυξημένα επίπεδα τόσο των προφλεγμονωδών όσο και των αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών και με αυξημένο ρόλο IL-10/IL-6. Η απάντηση των νεφροπαθών και των διαβητικών στο LTA ελέγχθηκε ικανοποιητική και ανάλογη αυτής των υγιών ατόμων, ενώ αυτή των βαριά πασχόντων υπολείπεται, αντικατοπτρίζοντας πιθανά την κατάσταση σχετικής ανοσοπαράλυσης στην οποία βρίσκονται.