Λειτουργικές και γονιδιωματικές μελέτες επί της αποαδενυλίωσης: ο ρόλος του γονιδίου PNLDC1

Abstract

Gene expression in eukaryotes is controlled in many levels including mRNA translation and decay. Both translation and mRNA stability are in general controlled by modulation of the mRNA’s poly(A) tail length. In the majority of the mRNAs, degradation also begins with the shortening of the poly(A) tail and subsequent degradation by the cytoplasmic exosome in a 3'-5' direction or by removal of the 5' cap structure by a decapping enzyme. Shortening of poly(A) (termed deadenylation) is carried out by a variety of 3'-5' exoribonucleases known as deadenylases. Deadenylases are Mg2+ dependent 3'-5' exoribonucleases that belong to one of two superfamilies, the DEDD type or the exonuclease-endonuclease-phosphatase (EEP) type. DEDD-type nucleases contain three conserved Asp and one Glu residue, which form the active site and coordinate the Mg2+ that support enzymatic activity. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει την POP2, την CAF1Z, την PAN2 και την poly(A)-specific ribonuclease (PARN). This group includes POP2, CAF1Z, PAN2 and poly(A)-specific ribonuclease (PARN). Herein we study the gene PNLDC1 that has been found to encode a novel deadenylase that is present in higher eukaryotes. PNLDC1 promoter is methylated whereas demethylation led to detectable expression in HEK293 cells. Both PNLDC1 isoforms that are produced through alternative splicing were studied. The biochemical characterization results showed similar activity and specificity with PARN, whereas both isoforms are located in the cytoplasm and mainly in the ER. Studies on the genes expression in various mouse tissue types, as well as cell lines revealed major expression of Pnldc1 in embryonic stem cells and gametes indicating a possible role during development. Silencing of the gene in mouse embryonic stem cells showed a deregulation of major pluripotency and differentiation factors. This observation indicates a central role during early development. In silico analyses through homology modeling and molecular dynamic simulation showed that PNLDC1 has a similar active site with the DEDD deadenylases and is a new member of the mRNA surveillance and turnover repertoire. Τhe fact that it exhibits strict epigenetic regulation, and specific subcellular localization is remarkable and has elusive so far physiological role which is currently under investigation. Regulation of mRNAs fate by deadenylation is critical for many biological processes including cell cycle, cellular response, oogenesis, spermatogenesis, early development and differentiation. Moreover, miRNA interference can trigger translational repression and mRNA degradation through deadenylation, emphasizing the unique role of this process in post transcriptional gene silencing.

Η γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ελέγχεται σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετάφρασης και την αποικοδόμησης του mRNA. Τόσο η μετάφραση όσο και η σταθερότητα του mRNA ρυθμίζονται από μεταβολές του μήκους της poly(A) ουράς τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η αποικοδόμηση των mRNAs ξεκινάει με την μείωση του μήκους της poly(A) ουράς και ακολουθεί αποικοδόμηση από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα με 3'-5', ή με απομάκρυνση του 5΄καλύμματος από το ένζυμο αφαίρεσης του καλύμματος. Η σταδιακή αποικοδόμηση της poly(A) ουράς που αναφέρεται ως αποαδενυλίωση πραγματοποιείται από μία πληθώρα 3'-5' εξωνουκλεασών που αποκαλούνται αποαδενυλάσες. Οι αποαδενυλάσες είναι μαγνησιο-εξαρτώμενες 3'-5' εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν σε μία από τις υπερ-οικογένειες αποαδενυλασών, την DEDD ή την EEP. Οι αποαδενυλάσες τύπου DEDD περιέχουν τρία συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα Asp και ένα κατάλοιπο Glu που σχηματίζουν το ενεργό κέντρο και καθορίζουν την διευθέτηση των ιόντων μαγνησίου τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στο καταλυτικό μηχανισμό. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει την POP2, την CAF1Z, την PAN2 και την poly(A)-specific ribonuclease (PARN). Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το γονίδιο PNLDC1 που βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια νέα DEDD αποαδενυλάση και βρίσκεται σε όλους του ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Ο προαγωγέας του γονιδίου PNLDC1 βρέθηκε μεθυλιωμένος και απομεθυλίωση του DNA οδήγησε στην ανίχνευση της έκφρασής του σε κυτταρική σειρά HEK293. H PNLDC1 βρίσκεται σε δύο ισομορφές οι οποίες προκύπτουν πιθανότατα από εναλλακτικό μάτισμα οι οποίες και μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Τα αποτελέσματα του βιοχημικού χαρακτηρισμού έδειξαν δραστικότητα και εξειδίκευση συγκρίσιμη με αυτή της PARN, ενώ οι δύο ισομορφές εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Μελέτες έκφρασης του γονιδίου σε διάφορους ιστούς και κυτταρικές σειρές έδειξε υψηλά εξειδικευμένη έκφραση σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, καθώς και σε γαμετικά κύτταρα υποδεικνύοντας έναν πιθανό ρόλο στη ανάπτυξη. Αποσιώπηση του γονιδίου σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού έδειξε να επηρεάζει σημαντικούς δείκτες πολυδυναμίας καθώς και σημαντικούς παράγοντες της διαφοροποίησης. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι η PNLDC1 πρέπει να κατέχει κεντρικό ρόλο στα αρχικά βήματα της κυτταρικής ανάπτυξης. Ιn silico ανάλυση και σχεδιασμός της δομής βάση ομολογίας και προσομοίωσης μοριακής δυναμική έδειξε ότι η PNLDC1 έχει παρόμοιο ενεργό κέντρο με DEDD αποδενυλάσες και αποτελεί ένα νέο μέλος στο ρεπερτόριο των ενζύμων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του mRNA. Ταυτόχρονα αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι υπόκειται σε αυστηρό επιγενετικό έλεγχο και ειδικό υποκυττάριο εντοπισμό με άγνωστη βιολογική λειτουργία που είναι όμως υπό διερεύνηση. Η ρύθμιση των mRNAs μέσω αποαδενυλίωσης είναι καθοριστική για πολλά βιολογικά φαινόμενα συμπεριλαμβανομένου των κυτταρικό κύκλο, την απόκριση σε εξωκυττάρια σήματα, ωογένεση και σπερματογένεση, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Επιπλέον τα miRNAs προκαλούν μεταφραστική αποσιώπηση και αποσταθεροποίηση του mRNA μέσω αποαδενυλίωσης, δίνοντας βαρύτητα στη διαδικασία αυτή στην μετα-μεταγραφική γονιδιακή αποσιώπηση.