Ανάπτυξη νανοφορέων για τη στοματική και οφθαλμική χορήγηση θεραπευτικών βιομορίων

Abstract

The primary aim of this thesis was the development of mucus permeating nanocarriers according to alternative mucus penetration strategies (e.g., controlled release of mucolytic agents, immobilization of proteolytic enzymes, etc.), that focus on the local and selective disruption of the mucus layer, thus facilitating the transport of nanocarriers and allowing them to deliver their therapeutic payload to the epithelium or to be uptaken by the epithelial cells. Additionally, a state-of-the-art mucus permeating nanocarrier-based system for controlled delivery of insulin was presented and critically assessed. Furthermore, the lack of efficient and safe gene delivery systems was addressed throughout this study. Two types of cationic liposomes (i.e., lipoplexes) were investigated for the therapeutic ocular gene delivery. More specifically, the first part of this thesis deals with the surface functionalization of poly(lactic-co-glycolide) PLGA nanoparticles with various proteolytic enzymes (i.e., trypsin, papain, bromelain) via a two-step carbodiimide coupling method. The enzyme-functionalized PLGA NPs were fully characterized with respect to their morphology, particle size distribution (PSD), zeta potential, enzyme conjugation efficiency, storage stability, effect on cell viability, enzymatic and mucolytic activity and their ability to permeate mucus. Furthermore, the mucolytic agent 4-mercaptobenzoic acid (4-MBA) was encapsulated in PLGA nanoparticles, as well as in liposomes, aiming to achieve controlled release of the mucolytic agent and, consequently, efficient transport of the nanocarriers through the mucus mesh. The effect of the initial concentration of 4-MBA on the properties of the produced NPs (i.e., average particle size, encapsulation efficiency of the mucolytic agent, release profile of 4-MBA from the nanoparticles) was examined. The 4-MBA loaded PLGA NPs were fully characterized with respect to their morphology, storage stability and effect on cell viability. Pegylated and non-pegylated liposomes containing 4-MBA were prepared by the hydration/extrusion method. The effect of the liposome composition (i.e., lipids combination and molar ratios) on the properties of the produced liposomes (i.e., average size, incorporation efficiency and release of the mucolytic agent) was examined. Moreover, a novel bifunctional liposomal formulation that incorporates the mucolytic agent 4-MBA in the lipid bilayers and a protein drug in the aqueous compartment was presented. Finally, the permeation rate of the 4-MBA nanocarriers was experimentally assessed in fresh porcine intestinal mucus. Additionally, a novel mucus permeating nanoemulsion for oral insulin delivery, incorporating a hydrophobic ion pair (HIP) of insulin/dimyristoyl phosphatidyl glycerol (INS/DMPG) was developed. The anionic lipid emulsions (ALEs) were examined with respect to mucus permeability, storage stability and effect on cell viability. Finally, the release of insulin from ALEs and their behavior in GIT conditions were experimentally investigated. Finally, throughout this study, the use of cationic liposomes for the effective ocular gene delivery was assessed. A comparative study of the physicochemical properties, DNA binding ability and transfection efficiency between freshly prepared pegylated and non-pegylated lipoplexes was conducted. Two lipoplexes formulations, one containing the cationic lipid, dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and the co-lipid cholesterol (CHOL) (DDAB:CHOL, 1:1) and the other containing additionally the pegylated lipid DSPE-PEG2000 (DDAB:CHOL:DSPEPEG2000, 1:1:0.04) were critically examined.

Η χορήγηση βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες ερευνητικές προκλήσεις στον τομέα της μεταφοράς φαρμάκων, κυρίως λόγω της χημικής και βιολογικής τους αστάθειας. Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί διάφορα συστήματα μεταφοράς βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών από τα οποία όμως κανένα δεν μπορεί να διαπεράσει τη βλέννα σε ικανοποιητικό βαθμό. Παράλληλα, οι συνήθεις τεχνολογίες για τη διάβαση της βλέννας οδηγούν σε διάρρηξη του συνολικού βλεννώδους ιστού κάτι το οποίο είναι ανεπιθύμητο από τοξικολογική άποψη. Για το λόγο αυτό κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη στρατηγικών που επικεντρώνονται στην τοπική και επιλεκτική διάρρηξη της βλέννας για την αποτελεσματική χορήγηση βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών. Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη επιφανειακά τροποποιημένων σωματιδίων με πρωτεολυτικά ένζυμα, αλλά και νανοφορέων που επιτρέπουν την ελεγχόμενη αποδέσμευση βλεννολυτικών παραγόντων με στόχο την επιτυχή διαπέραση του εμποδίου της βλέννας. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος της διατριβής ασχολείται με την επιφανειακή τροποποίηση νανοσωματιδίων πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA) με τα πρωτεολυτικά ένζυμα τρυψίνη, παπαῒνη και βρωμελαῒνη. Τα παραγόμενα πολυμερικά νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν λεπτομερώς σε σχέση με τη μορφολογία τους, την κατανομή μεγέθους τους (PSD), το επιφανειακό τους φορτίο, το ποσοστό σύζευξης του ενζύμου, τη σταθερότητα κατά την αποθήκευση, την κυτταροτοξικότητά τους, την ενζυμική και βλεννολυτική δραστικότητα και την ικανότητά τους να διαπερνούν τη βλέννα. Σχετικά με τον εγκλεισμό βλεννολυτικών παραγόντων σε νανοφορείς, παρασκευάστηκαν νανοσωματίδια PLGA και λιποσώματα που φέρουν το βλεννολυτικό παράγοντα 4-μερκαπτοβενζοϊκό οξύ (4-MBA) σε υψηλά ποσοστά φόρτωσης (≤18.43 wt%). Τα νανοσωματίδια PLGA χαρακτηρίστηκαν από γρήγορη αποδέσμευση του 4-MBA (>80 wt% σε 20 min) ενώ ο εγκλεισμός του βλεννολυτικού παράγοντα στα λιποσώματα επέτρεψε την ελεγχόμενη αποδέσμευσή του (≤30 wt% σε 45 min). Τα λιποσώματα που φέρουν 4-MBA βρέθηκαν να εμφανίζουν υψηλά ποσοστά διαπερατότητας της βλέννας εξαρτώμενα από το ρυθμό αποδέσμευσης του βλεννολυτικού παράγοντα και τη σύσταση της λιπιδικής διπλοστοιβάδας. Επιπλέον, στα πλαίσια της διατριβής αυτής, παρουσιάστηκε ένα καινοτόμο νανοδομημένο σύστημα μεταφοράς φαρμάκου για την ελεγχόμενη στοματική χορήγηση ινσουλίνης. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε ένα καινοτόμο νανογαλάκτωμα που ενσωματώνει το υδρόφοβο σύμπλοκο ινσουλίνης με το ανιονικό φωσφολιπίδιο διμυριστοϋλο φωσφατιδυλογλυκερίνη (INS/DMPG), πετυχαίνοντας υψηλά ποσοστά φόρτωσης του θεραπευτικού βιομορίου. Τα ανιονικά λιπιδικά γαλακτώματα εξετάστηκαν σε σχέση με την κατανομή μεγέθους τους (PSD), το επιφανειακό τους φορτίο, τη σταθερότητα κατά την αποθήκευση, την κυτταροτοξικότητά τους και την ικανότητά τους να διαπερνούν τη βλέννα. Τέλος, ο ρυθμός απελευθέρωσης της ινσουλίνης από τα νανογαλακτώματα μελετήθηκε πειραματικά. Στο τελευταίο μέρος της παρούσας μελέτης, ερευνήθηκε η σύνθεση αποτελεσματικών μη ιικών συστημάτων γονιδιακής μεταφοράς. Δύο τύποι κατιονικών λιποσωμάτων (σύμπλοκα λιπιδίων με DNA) εξετάσθηκαν ως μη ιικοι φορείς για τη θεραπευτική απόδοση γονιδίου. Συγκεκριμένα, διεξήχθη μια συγκριτική μελέτη μεταξύ ενός πεγκυλιωμένου και ενός μη πεγκυλιωμένου συμπλόκου λιπιδίου-DNA σχετικά με τις φυσικοχημικές ιδιότητές τους, την ικανότητα δέσμευσης του DNA και την δυνατότητα μεταφοράς του γενετικού τους φορτίου στον πυρήνα των κυττάρων.