Διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της επαγόμενης από τη μεθυλοτρανσφεράση της μεθυλογουανίνης αντοχής στην τεμοζολομίδη και της οδού ουβικουιτίνης-ορωτεασώματος στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα

Abstract

Εισαγωγή: Η καθιερωμένη θεραπεία του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος, που περιλαμβάνει τον αλκυλιωτικό παράγοντα τεμοζολομίδη (ΤΜΖ), είναι συχνά αναποτελεσματική λόγω της ύπαρξης εγγενούς ή της ανάπτυξης δευτερογενούς χημειοαντοχής που εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA από το ένζυμο μεθυλοτρανσφεράση της μεθυλογουανίνης (MGMT). Διάφορες θεραπευτικές στρατηγικές έχουν χρησιμοποιηθεί με σκοπό την άμεση αναστολή της MGMT με τη χρήση ψευδοϋποστρωμάτων όπως η Ο6-βενζυλογουανίνη (O6-BG), ωστόσο η ταχεία ανάκαμψη των επιπέδων της MGMT μετά τη διακοπή της θεραπείας εμποδίζει την εφαρμογή τους στην κλινική πράξη. Επιπλέον λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην επαγωγή της MGMT μετά τη βλάβη του DNA. Η οδός ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος περιλαμβάνει μια σειρά αντιδράσεων σηματοδότησης με πρωταγωνιστή την ουβικουιτίνη που καταλήγουν στην αποδόμηση αποδιαταγμένων ή κατεστραμμένων πρωτεινών του κυττάρου από ένα πολύπρωτεινικό σύμπλεγμα, το 26S πρωτεάσωμα. Μέσα στην πληθώρα των πρωτεινών με διάφορες κυτταρικές λειτουργίες που ελέγχονται πρωτεολυτικά από το πρωτεάσωμα ανήκει και η MGMT. Η φαρμακευτική αναστολή του πρωτεασώματος από τον παράγοντα μπορτεζομίμπη (BZ) έχει αποδείξει την αντικαρκινική της δράση σε διάφορα πειραματικά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένου και του γλοιοβλαστώματος, και χρησιμοποιείται σε κλινικό επίπεδο για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος και του λεμφώματος από κύτταρα μανδύα. Ωστόσο, η ύπαρξη άμεσης επίδρασης της αναστολής του πρωτεασώματος στην έκφραση της MGMT δεν έχει διερευνηθεί. Επιπλέον, η προσθήκη ΒΖ στην ΤΜΖ ως στρατηγική χημειοευαισθητοποίησης των γλοιωμάτων έχει δοκιμαστεί σε κλινικές μελέτες αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη δράση του συνδυασμού δεν έχουν εξηγηθεί. Τα παραπάνω ερωτήματα αποτέλεσαν το αντικείμενο της παρούσας in vitro έρευνας. Υλικά και μέθοδοι: Οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πολύμορφου γλοιοβλαστώματος Τ98G (με υψηλή έκφραση MGMT και μετάλλαξη του p53, mt p53) και U87 (με χαμηλή έκφραση MGMT και φυσιολογικό p53, wt p53) καλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό Dulbecco’s modified Eagle’s medium με την παρουσία ή χωρίς ΤΜΖ, Ο6-ΒG, BZ και συνδυασμών ΤΜΖ− Ο6-ΒG και ΤΜΖ−ΒΖ. Εκτιμήθηκαν η επιβίωση και η απόπτωση των κυττάρων χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες μεθυλ-τριαζολυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ) και κατακερματισμού του DNA καθώς και τα επίπεδα της ενεργοποιημένης κασπάσης 3 με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών. Επιπλέον εκτιμήθηκε η υποκυτταρική εντόπιση και τα επίπεδα έκφρασης της MGMT με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών, και με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR). Επίσης μετρήθηκε η δραστικότητα του 20S πρωτεασώματος με φλουρομετρική μέθοδο. Τέλος εκτιμήθηκαν η υποκυτταρική εντόπιση (με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών και ανοσοφθορισμό), τα επίπεδα και ο βαθμός ενεργοποίησης της πρωτεΐνης NF-κB, τα επίπεδα IκBα, p53 και HIF-1α, τα επίπεδα και ο βαθμός ενεργοποίησης των πρωτεϊνών eIF2α, MAPK, ΑΚΤ, και STAT3, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης της MGMT και ταυτόχρονα ρυθμίζονται άμεσα ή έμμεσα από την οδό ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος. Αποτελέσματα: Ο συνδυασμός Ο6-ΒG−ΤΜΖ αύξησε την κυτταροτοξικότητα της ΤΜΖ μειώνοντας την επιβίωση των Τ98G κυττάρων. Παράλληλα παρατηρήθηκε μείωση της MGMT σε επίπεδο mRNA και πρωτείνης, μείωση των επιπέδων NF-κB και mt p53 και μικρή μείωση της πρωτεασωμικής δραστικότητας. Ωστόσο, 24 ώρες μετά την απομάκρυνση των φαρμάκων η επιβίωση των κυττάρων, η έκφραση της MGMT και η δραστικότητα του πρωτεασώματος επανήλθαν στα βασικά επίπεδα και τα φαινόμενα αυτά συνδυάστηκαν με αύξηση των επιπέδων NF-κB και mt p53. H BZ, ως μονοθεραπεία, ήταν δραστική στα T98G κύτταρα, οδηγώντας σε μείωση της επιβίωσης και επαγωγή της απόπτωσης. Αυτή η έκβαση συνδυάστηκε με ελάττωση της έκφρασης της MGMT σε επίπεδο mRNA και πρωτείνης, ελάττωση του πυρηνικού και ολικού NF-κB, αύξηση του IκBα και φωσφορυλίωση του eIF2α. Οι συνδυασμοί ΤΜΖ−ΒΖ στα Τ98G και U87 κύτταρα είχαν διαφορετική επίδραση στην κυτταροτοξικότητα ανάλογα με τη αλληλουχία χορήγησης. Μέγιστη μείωση της επιβίωσης και επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκε στα Τ98G με την πρώιμη επώαση με ΒΖ ακολουθούμενη από ΤΜΖ, ενώ στα U87 η όψιμη προσθήκη ΒΖ μετά την ΤΜΖ ήταν πιο δραστική. Ωστόσο, και στις δύο περιπτώσεις η μέγιστη κυτταροτοξικότητα συνδυάστηκε με τη μέγιστη καταστολή των επιπέδων πυρηνικής MGMT και πυρηνικού NFκB, με τη σταθεροποίηση του wt p53, και με τη μέγιστη αναστολή ενεργοποίησης των MAPK, AKT, STAT3 και HIF-1α. Συμπεράσματα: Η αποτυχία της O6-BG να οδηγήσει σε παρατεταμένη χημειοευαισθητοποίηση σε κύτταρα με mt p53 σχετίζεται με επαγωγή νέας έκφρασης MGMT από τους μεταγραφικούς παράγοντες NFκB and mt p53. Η αναστολή του πρωτεασώματος από την BZ καταστέλλει την έκφραση MGMT μέσω μείωσης της μεταγραφής της από τον πυρηνικό NFκB και της μετάφρασης από τη φωσφορυλιωμένη eIF2α. Η αναστολή του πρωτεασώματος από την BZ αναστέλλει την ΜGMT-εξαρτώμενη αντοχή στην ΤΜΖ ανάλογα με την αλληλουχία χορήγησης ΤΜΖ−ΒΖ, η οποία διαφέρει μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών σειρών αλλά υπαγορεύεται σταθερά από τη μέγιστη αναστολή των ρυθμιστών της ΜGMT.