Διερεύνηση γονιδίων που ενέχονται στον υπερτροφικό φαινότυπο οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων

Abstract

Purpose: The purpose of the present thesis is the investigation of the molecular basis of hypertrophy of osteoarthritic chondrocytes through evaluation of the expression of genes that induce hypertrophy, such as BMP-2 and β-catenin, the implicated mechanisms controlling their action, and inhibition of their expression using microRNAs. Methods: Expression of genes involved in BMP and Wnt/β-catenin signaling pathways was evaluated using real-time PCR and Western blot. Performing BMP-2 and LiCl treatment in chondrocytes and using ChIP assay we investigated the role of the interaction between BMP-2 and Wnt/β-catenin signaling pathway on the expression of catabolic enzymes and hypertrophic markers in osteoarthritic chondrocytes. Finally, the role of miR-140 on BMP-2 expression and articular cartilage degeneration in osteoarthritis was investigated after miR-140 treatment in OA chondrocytes. Results: We observed that BMP-2, BMPR-IA, LRP-5 and LEF-1 expression levels were significantly upregulated in osteoarthritic chondrocytes compared to normal. BMP-2 treatment in chondrocytes increased LRP-5 and the nuclear active form β-catenin levels and analysis of LRP-5 promoter showed the presence of Smads response elements that permit the binding of Smad1/5/8 complex and the direct regulation of LRP-5 transcription by BMP-2. We also observed that the activation of β-catenin by BMP-2 increased MMP-13, MMP-9, ADAMTS-5 and collagen X expression in chondrocytes and that the above genes are targets of Wnt/β-catenin signaling, as we demonstrated conserved LEF-binding sites in MMP-9, 13, 14, ADAMTS-5 and COL10A1 promoters, responsible for their promoter activity and associated directly with β-catenin/LEF-1 complex. Finally, miR-140 treatment in osteoarthritic chondrocytes resulted in a decrease of BMP-2 expression and subsequent inhibition of Wnt/β-catenin signaling as well as all molecules induced by it that leading to articular cartilage degeneration. Conclusion: Our novel findings suggest the implication of BMP-2 and Wnt/β-catenin signaling pathways in chondrocytes’ hypertrophy and cartilage degradation in osteoarthritis. Moreover, miR-140 through blocking BMP-2 expression and Wnt/β-catenin signaling resulted in downregualation of catabolic and hypertrophy markers and could be therefore recommended as a new therapeutic target for OA treatment, highlighting the clinical importance of our results.

Σκοπός: Αντικείμενο της διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της μοριακής βάσης της υπερτροφίας των οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων μέσω της μελέτης της έκφρασης γονιδίων που επάγουν την υπερτροφία, όπως η ΒΜΡ-2 και η β-κατενίνη, των εμπλεκόμενων μηχανισμών που ελέγχουν τη δράσης τους, καθώς και η αναστολή της έκφρασής τους με τη χρήση microRNAs. Μεθοδολογία: Ο προσδιορισμός της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι των ΒΜΡs και της β-κατενίνης έγινε με τις μεθόδους της real-time PCR και του Western blot. Η μελέτη της αλληλεπίδρασης των παραπάνω μορίων έγινε με τη χορήγηση BMP-2 και LiCl στα χονδροκύτταρα και με τη μέθοδο της Ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης. Τέλος, έγινε χορήγηση του miR-140 στα χονδροκύτταρα προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του στη γονιδιακή ρύθμιση της ΒΜΡ-2. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της BMP-2, του BMPR-IA, του LRP-5 και του LEF-1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα συγκριτικά με τα φυσιολογικά. Η επαγωγή με ΒΜΡ-2 στα χονδροκύτταρα επέφερε αύξηση της έκφρασης του LRP-5 και της ενεργούς μορφής της β-κατενίνης ενώ ανάλυση του υποκινητή του LRP-5, έδειξε για πρώτη φορά, ότι διαθέτει περιοχές δέσμευσης των μεταγραφικών παραγόντων Smad1/5/8. Επίσης, διαπιστώθηκε πως η ενεργοποίηση της β-κατενίνης από την ΒΜΡ-2 επάγει την έκφραση των καταβολικών ενζύμων MMP-9, 13, 14, ADAMTS-5 και του δείκτη υπερτροφίας COL10A1 και παρατηρήθηκε πως τα ανωτέρω γονίδια αποτελούν άμεσους στόχους του σηματοδοτικού μονοπατιού της β-κατενίνης καθώς βρέθηκαν θέσεις σύνδεσης του μεταγραφικού παράγοντα LEF-1, μέσω του οποίου ασκεί τη δράση της η β-κατενίνη, στους υποκινητές των γονιδίων. Τέλος, η χορήγηση του miR-140 στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα επέφερε μείωση της έκφρασης της BMP-2 με αποτέλεσμα την αναστολή της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της β-κατενίνης και όλων των μορίων που επάγονται από αυτή και οδηγούν στον εκφυλισμό του αρθρικού χόνδρου. Συμπεράσματα: Αναδείχτηκε η εκτεταμένη ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών της ΒΜΡ-2 και της β-κατενίνης στα ΟΑ χονδροκύτταρα η οποία οδηγεί στην αύξηση της μεταβολικής δραστηριότητας των χονδροκυττάρων και στην ωρίμανση τους σε υπερτροφικά. Τέλος, το miR-140 μέσω της αναστολής της έκφρασης της BMP-2 και όλων των διαδικασιών που επάγονται από τη δράση της και οδηγούν στον εκφυλισμό του αρθρικού χόνδρου, προτείνεται ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για την αναστολή της εξέλιξης της ΟΑ σε πρώιμα στάδια.