Ο ρόλος των πολυαμινών στη διαχείριση των φωτονίων και των πρωτονίων από τη φωτοσυλλεκτική κεραία του φωτοσυστήματος ΙΙ

Abstract

The plant light-harvesting complex of photosystem II (LHCII) functions not only to absorb and deliver solar energy to the photosystem II (PSII) reaction centers, but also to protect them from overexcitation. LHCII dissipates excess solar energy as thermal energy under high light conditions, in a process that is referred to as non-photochemical quenching (NPQ) (Horton et al., 1994). The molecular mechanism of high energy quenching (qE), the rapidly inducible and reversible component of NPQ which is triggered when ΔpH across the thylakoid membrane is increased, remains unresolved. The predominant hypothesis claims that an energy quenching center is formed from the interaction between specific xanthophyll and chlorophyll (Chl) molecules due to the ΔpH-induced changes in internal pigment organization of trimeric or monomeric proteins of LHCII (Horton et al., 2000; Pascal et al., 2005; Ruban et al., 2007; Ahn et al., 2008). This work is focused on the role of polyamines (PAs) in qE. The main PAs (putrescine, Put, spermidine, Spd and spermine, Spm) are found in vivo in chloroplast and bound to LHCII (Navakoudis et al., 2007), while upon illumination they accumulate in lumen (Ioannidis et al., 2012). In order to gradually focus on the mechanism in vitro a bottom-up bioenergetic approach was adopted. Initially, it was tested in detail the mode of interaction of all three PAs with isolated Chls as well as with their water-soluble analogue chlorophyllin (SCC). The results showed that all three PAs bind to the Mg ion of Chls and shift their coordination-state equilibrium. For the first time, spectroscopic data are presented for the axial ligation of Chl b. The coordination of Spm with Chl b has the most interesting features from all pigments tested. Spm induces reversible increases and decreases of the fluorescence yield of Chl b at about 661nm. Interestingly, equilibrium between a high-fluorescence yield conformation and a low yield is feasible by the interaction of Chl b and aminic ligands. Most probably Spm binds axially to the Mg of Chl b via its imino groups, as revealed by experiments with SCC showing that the mode of interaction is dependent upon their protonation state. Furthermore, new absorption data for the diagnostic region of 535nm, related to qE, are provided and discussed. Then, the interaction of PAs with isolated and purified complexes of the PSII antenna was studied. At physiological pH, PAs stimulate fluorescence quenching of both trimeric LHCII and monomeric LHCb complexes, mimicking the action of protons. Spm was the most potent quencher and induced aggregation of LHCII trimers, due to its highly cationic character. It seems that the mechanism of Spm-induced aggregation comprises a surface charge screening of LHCII until larger aggregates are formed. Spm-induced and qE-induced LHCII aggregation results in the same conformation as revealed by Raman spectroscopy. A possible interpretation of these results is that amines or/and amine-induced aggregation lead to deeper insertion of the Mg in the macrocycle and this quenches fluorescence of one Chl creating a sink that quenches the fluorescence of the LHCII. A putative site of this mechanism could be the domain that ligates Chl8 of LHCII, as it was shown by in silico analysis that it has similar structure to the domain of heme in myoglobin that modulates the positioning of the metal in heme. In the third part of this work, the antenna complexes were reconstituted into proteoliposomes in an attempt to mimic in vitro their in vivo conditions. Conductivity measurements showed that both monomeric and trimeric complexes increased the membrane permeability to protons when in a partly aggregated state. The Spm-induced aggregation of LHCII within the lipid phase was found to increase the non-specific proton permeation across the membrane. On the other hand, addition of Spm to already incorporated complexes reduced their permeability, indicating that LHCII may also serve as a specific channel to protons. All in all, a new model for the photoprotection of the photosynthetic apparatus by Spm is discussed.

Η φωτοσυλλεκτική κεραία του φωτοσυστήματος ΙΙ (LHCII) των φυτών λειτουργεί όχι μόνο απορροφώντας και μεταφέροντας την ηλιακή ενέργεια στα κέντρα αντίδρασης του φωτοσυστήματος ΙΙ (PSII), αλλά και προστατεύοντάς τα από την περίσσεια πίεση διέγερσης. Υπό συνθήκες υψηλού φωτισμού, το LHCII διαχέει την περίσσεια φωτονιακή ενέργεια ακίνδυνα στο περιβάλλον ως θερμότητα, μέσω του μηχανισμού της μη-φωτοχημικής απόσβεσης της ενέργειας (NPQ) (Horton et al. 1994). Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του συντελεστή qE του NPQ, που επάγεται αστραπιαία όταν αυξάνεται το ΔpH κατά μήκος της μεμβράνης των θυλακοειδών παραμένει άγνωστος. Η επικρατούσα θεωρία υποστηρίζει τη δημιουργία κάποιου κέντρου διάχυσης της ενέργειας από την αλληλεπίδραση κάποιας χλωροφύλλης (Chl) με κάποια ξανθοφύλλη που προκύπτει από την επαγόμενη από το ΔpH αλλαγή της οργάνωσης των χρωστικών σε κάποιο τριμερές ή μονομερές σύμπλοκο του LHCII (Ahn et al. 2008, Horton et al. 2000, Pascal et al. 2005, Ruban et al. 2007). Η παρούσα εργασία εστιάζεται στη μελέτη του ρόλου των πολυαμινών (ΠΑς) στο μηχανισμό του qE. Οι τρεις κύριες ΠΑς (πουτρεσίνη, Put, σπερμιδίνη, Spd και σπερμίνη, Spm) εντοπίζονται in vivo στο χλωροπλάστη προσδεμένες στο LHCII (Navakoudis et al., 2007) ενώ σε συνθήκες υψηλού φωτισμού συσσωρεύονται στο μικροχώρο (Ioannidis et al., 2012). Για τη σταδιακή εστίαση στο μηχανισμό υιοθετήθηκε μια in vitro βιοενεργητική πειραματική προσέγγιση από-το-ειδικό-στο-γενικό. Αρχικά, μελετήθηκαν διεξοδικά οι αλληλεπιδράσεις των ΠΑς με απομονωμένες Chls και με το υδατοδιαλυτό ανάλογό τους, τη χλωροφυλλίνη (SCC). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι τρεις ΠΑς προσδένονται αξονικά μέσω των αμινομάδων τους στο Mg των Chls, αλλάζοντας την κατάσταση συναρμογής του. Παρουσιάζονται τα φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά της αξονικής πρόσδεσης της Chl b, η οποία αλληλεπιδρά με τη Spm με ξεχωριστό τρόπο. Η Spm επάγει αντιστρεπτές αυξομειώσεις στα επίπεδα του φθορισμού της Chl b στα 661nm. Αμινικοί υποκαταστάτες όπως η Spm μπορούν να μετακινήσουν την ισορροπία της Chl b από μια διαμόρφωση διάχυσης της ενέργειας σε μια Pheo-like διαμόρφωση (μεγάλης εκπομπής φθορισμού) ή και το αντίθετο. Η πρόσδεση της Spm στο Mg της Chl b φαίνεται να περιλαμβάνει τις ιμινομάδες του μορίου της, καθώς πειράματα με την SCC ανέδειξαν τον εξαρτώμενο από το βαθμό πρωτονίωσής τους χαρακτήρα της αλληλεπίδρασης. Επιπλέον, νέα φασματοσκοπικά δεδομένα προέκυψαν για την προέλευση του ΔΑ535 που σχετίζεται βιβλιογραφικά με την επαγωγή του qE. Έπειτα, μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των ΠΑς με απομονωμένα και λειτουργικά φωτοσυλλεκτικά σύμπλοκα της κεραίας του PSII. Οι ΠΑς βρέθηκε ότι επάγουν την απόσβεση του φθορισμού τόσο των τριμερών LHCII όσο και των μονομερών LHCb συμπλόκων σε φυσιολογικές τιμές pH, μιμούμενες τη δράση των πρωτονίων. Η απόσβεση του φθορισμού του LHCII από τη Spm συμβαίνει ταχύτατα μέσω της σάρωσης των αρνητικών φορτίων στην επιφάνειά του και στη συνέχεια σχηματίζονται μεγάλα συσσωματώματα. Η συσσωμάτωση που επάγεται από τη Spm οδηγεί στη διαμόρφωση διάχυσης της ενέργειας του LHCII που απαντάται κατά την ενεργοποίηση του qE, όπως έδειξαν τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας Raman. Όλα τα παραπάνω δείχνουν πως οι αμίνες, άμεσα (ως υποκαταστάτες του Mg) ή/και έμμεσα (μέσω της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνικών συμπλόκων) οδηγούν στην μετατόπιση του Mg μιας Chl εντός του τετραπυρρολικού δακτυλίου της, αποσβένοντας την ενέργεια. Μάλιστα, μετά από in silico μελέτη των δομών της κεραίας υποδεικνύεται ως πιθανότερη υποψήφια για αυτόν τον ρόλο η Chl 8. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, τα φωτοσυλλεκτικά σύμπλοκα ενσωματώθηκαν σε λιποσώματα σε μια προσπάθεια μελέτης τους σε ένα περιβάλλον που προσομοιώνει τις in vivo συνθήκες. Μελέτες αγωγιμότητας των πρωτεολιποσωμάτων σε πρωτόνια έδειξαν ότι τόσο τα τριμερή, όσο και τα μονομερή σύμπλοκα της κεραίας αυξάνουν τη διαπερατότητα τους όταν βρίσκονται στις μεμβράνες υπό μερική συσσωμάτωση. Η Spm επάγει τη μερική συσσωμάτωση των LHCII συμπλόκων που όταν ενσωματωθούν σε λιποσώματα αυξάνουν τη μη-ειδική μεταφορά των πρωτονίων, ενώ αντίθετα η προσθήκη Spm σε ήδη ενσωματωμένα σύμπλοκα βρέθηκε να μειώνει την αγωγιμότητά τους, υποδεικνύοντας την ύπαρξη και ειδικής μεταφοράς. Όλα τα παραπάνω επιτρέπουν να προταθεί ένα μοντέλο φωτοπροστασίας του φωτοσυνθετικού μηχανισμού από τη Spm.